重視植入前遺傳學診斷及篩查技術的安全性

作者：孫瑩璞

來源：中國實用婦科與產科雜誌

自1990年世界上誕生第1例植入前遺傳學診斷（PGD）試管嬰兒至今，已有25年的歷史。

植入前遺傳學診斷是對胚胎進行遺傳學分析和診斷，去除有遺傳缺陷的胚胎，選擇診斷正常的胚胎植入子宮的一種診斷方法。

PGD將遺傳學技術與輔助生殖技術相結合，將遺傳病診斷提前到胚胎植入宮腔之前，避免了因選擇性流產給婦女及其家庭帶來的傷害。

另外，對於反覆流產、反覆種植失敗的夫婦，可以利用植入前遺傳學篩查（PGS）技術選擇診斷正常胚胎移植以改善臨床結局。

因此，PGD、PGS在輔助生殖技術中越來越受到重視。

目前PGD的臨床適應證主要包括染色體病、單基因病及性連鎖遺傳病攜帶者夫婦等。

PGS的臨床適應證主要包括高齡、反覆流產、反覆種植失敗、重度少弱精症及高風險遺傳病患兒出生傾向的夫婦等。

近年來，PGD技術也用於人類白細胞抗原（HLA）配型以挽救同胞血液病患兒及腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌等）相關基因篩查以降低子代患病風險等。

PGD、PGS主要步驟包括通過體外受精（IVF）、卵泡漿內單精子顯微注射（ICSI）獲得胚胎、胚胎活檢、遺傳學檢測及正常胚胎移植等。

隨著胚胎活檢技術、胚胎玻璃化冷凍技術的成熟以及單細胞遺傳學檢測技術的發展和新的遺傳學診斷技術的引入，PGD、PGS應用範圍不斷擴大，周期數日益增多，因此，PGD、PGS的安全性愈來愈受人們關注。

本文圍繞PGD、PGS中活檢技術的安全性、常用遺傳學檢測技術的可靠性及子代安全性等問題進行討論。

1、胚胎活檢時機及其安全性

胚胎活檢是PGD、PGS的主要步驟之一，主要包括胚胎透明帶開孔及胚胎活檢。

根據透明帶開孔的方法不同，可分為機械法、化學法及雷射法。

目前比較常用的為雷射法。

不同的透明帶開孔方法的安全性仍然缺乏大樣本的數據及定論。

關於透明帶開孔方法對胚胎髮育的影響，不同的作者有不同的觀點。

一般認為化學法和雷射法的囊胚形成率和囊胚質量無差異，而雷射法活檢後的胚胎完整性好於化學法。

但由於雷射法簡便、快速和精確，因此是PGD活檢的主要方法，但是雷射熱效應對胚胎髮育的影響仍然不容忽視。

根據胚胎髮育階段，胚胎活檢可以分為極體活檢、卵裂期活檢及囊胚期活檢。

極體活檢指對第一、二極體進行的活檢及遺傳學分析，間接推測卵子的遺傳物質是否正常或者是否攜帶有致病基因，其局限性是無法分析來源於父方的遺傳物質，不能進行性別診斷等。

關於極體活檢對胚胎髮育的影響，Levin等分析了雷射法進行極體活檢對胚胎髮育的影響，結果顯示極體活檢會導致胚胎碎片增多及細胞數減少，但作者未分析胚胎種植率等數據。

卵裂期胚胎活檢是目前應用最廣泛的胚胎活檢方法。

一般認為卵裂球活檢能夠反映父源、母源的遺傳信息，同時卵裂球是全能的，移去1～2個細胞不會影響胚胎的繼續發育潛能。

Kirkegaard等報導，卵裂球活檢的胚胎其緻密化，桑葚胚、早期囊胚等形成時間明顯延長，同時活檢後胚胎形成囊胚的直徑明顯減少，透明帶厚度明顯增加。

這些說明活檢過程和胚胎細胞數減少對胚胎其餘卵裂球的繼續分裂存在影響。

囊胚期胚胎活檢被認為是最有前景的胚胎活檢方法，這得益於體外胚胎培養系統的完善和囊胚冷凍解凍技術的提高。

囊胚期活檢的優點主要有：能夠提供較多的細胞進行分析，增加了診斷的可靠性，同時活檢的滋養外胚層細胞不參與形成胎兒，僅形成胎盤，不危及胎兒的正常發育。

其缺點主要是胚胎的冷凍解凍導致的胚胎的損傷等。

Scott等比較了囊胚期胚胎活檢和卵裂期胚胎活檢的胚胎種植率，結果顯示卵裂期胚胎活檢導致胚胎種植率下降39%，而囊胚期活檢並不導致胚胎種植率下降。

隨著冷凍解凍技術的提高，囊胚期胚胎活檢技術在PGD、PGS中扮演愈來愈重要的角色。

2、PGD、PGS中常用遺傳學檢測技術的可靠性

胚胎的遺傳學診斷是PGD、PGS中重要的步驟之一。

傳統的單細胞診斷方法主要有螢光原位雜交技術（FISH）和PCR技術。

近年來新的遺傳學診斷技術不斷地應用於PGD、PGS，如微陣列技術及二代測序技術等。

PCR主要用於單基因病PGD，同時也用於HLA配型、性連鎖基因和性別鑑定等。

但是單細胞PCR的局限性主要是容易發生等位基因脫扣（allele drop-out，ADO）或等位基因選擇性擴增（preferential amplification，PA），發生率可達10%~25％，嚴重影響分析結果的準確性。

而FISH技術主要用於胚胎染色體非整倍體及性別的檢測，其局限性主要是對有限的染色體（10~12對）進行分析，另外對複雜的平衡易位不易做出正確的診斷。

同時探針的雜交失敗、信號的重疊、分離等都影響診斷結果。

Moutou等報導PCR-PGD的誤診率為0.15%，而FISH-PGD誤診率為0.06%。

PGD誤診的後果主要有出生遺傳病患兒、自然流產及終止妊娠等，這些都給患者帶來巨大的影響。

因此，PGD誤診情況需要足夠重視，儘量減少PGD誤診情況發生。

微陣列技術及二代測序技術是近年來應用於PGD、PGS新的診斷技術。

微陣列技術主要有微陣列比較基因組雜交（array CGH）和單核苷酸多態性微陣列（SNP array）。

array CGH是將基因組中感興趣的靶點做成微陣列晶片，然後將等量的不同螢光標記的待測和對照基因組DNA與其雜交，根據微陣列每個靶點上兩種信號的螢光比率來反映待檢測基因組DNA中相對應序列拷貝數的變化。

SNP微陣列是應用已知的核苷酸序列作為探針與待測DNA序列進行雜交，通過對信號的檢測進行定性與定量分析。

一般而言，SNP 是指變異頻率大於1 %的單核苷酸變異。

在人類基因組中大概每1000 個鹼基就有1個SNP，人類基因組上的SNP 總量大約為3 ×106 個。

相對於傳統的單細胞診斷方法，微陣列技術屬於高通量的檢查方法，其主要優點是可以檢測胚胎全染色體組非整倍體篩查及結構異常。

另外，相比於array CGH，SNP array具有更多的優點如解析度更高，能檢測單親二倍體、三倍體等。

但二者仍然存在缺點，如不能檢測平衡性的基因組易位及倒位，同時胚胎活檢後的單細胞DNA量（5~6 pg）無法滿足進行微陣列分析最少DNA量（200~300 ng）要求，因此，活檢後細胞需先進行全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）才能得到上述DNA產量。

而全基因組擴增的DNA產物其保真度並非100％，這些都可能會影響到微陣列診斷分析的準確性。

Colls 等分析了array CGH診斷結果和再次FISH結果的一致性，顯示array CGH進行PGD的誤診率為1.9%。

目前尚未見SNP微陣列進行PGD的誤診率的相關報導。