單細胞檢測在優生領域將大顯身手，但標準缺失嚴重掣肘行業發展

11月23~24日，2017中國精準醫療產業領袖峰會暨第七屆Bio4P中國醫健創新創業大會在杭州盛大舉行。

24日上午，在單細胞診斷論壇上，國家輔助生殖與優生工程技術研究中心、山東大學附屬生殖醫院分子遺傳室主任高媛作了精彩報告。

請山東大學附屬生殖醫院分子遺產室主任高媛點擊此處輸入圖片描述

以下為嘉賓演講全文整理：

今天我主要圍繞單細胞基因檢測在優生領域中的應用和大家作下分享。

隨著二胎政策放開以後，很多的夫婦會提前到醫院諮詢能否生一個健康的孩子，這也促使生殖領域工作者不僅要幫育齡夫婦解決生育的問題，同時還要幫助他們生育健康的孩子。

生殖細胞在體外受精形成胚胎之後，如何確定這個胚胎健康與否？通過胚胎植入前遺傳檢測可以做部分判斷。

當未見異常的胚胎移植到母體後，在分娩前還有一道屏障，就是進行產前診斷。

出生後還有一個新生兒篩查，以上這就是目前預防出生缺陷發生而進行的三級預防，分別在孕前、產前和新生兒三個時期進行監控的三個點。

單細胞檢測在生殖領域當中如何實現應用？目前主要是在胚胎植入前遺傳學診斷中，也就是所謂的三代試管中應用的最多。

胚胎植入前遺傳學診斷，（Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD）是指在體外受精過程中，對具有遺傳風險患者的胚胎進行植入前活檢和遺傳學分析，以選擇無已知遺傳學疾病的胚胎植入宮腔，從而獲得正常胎兒的診斷方法。

這種方法可有效地防止遺傳性疾病患兒的出生，是產前診斷的延伸，也是遺傳學診斷的新技術。

胚胎植入前遺傳學篩查，也就是PGS（preimplantation genetic screening，PGS）是對早期胚胎進行染色體數目和結構異常的檢測，篩查出未見染色體異常的胚胎植入，從而提高著床和妊娠的成功率。

在臨床上，PGD和PGS整個流程技術基本一致，不同地是PGS是針對全基因組水平上的染色體檢測，主要是染色體層面上的篩查。

而PGD則是針對有非常明確問題的胚胎，比如染色體的數目或結構異常、明確的單基因遺傳病都可以通過PGD對胚胎進行篩選。

但PGS在臨床上應用更加廣泛。

對於PGS，歐洲ESHER有PGS適應徵的相關指南，其中規定36歲以上的婦女，三次以上的優質胚胎移植以後著床失敗的，以及多次胚胎移植總移植胚胎數大於10次著床失敗和3次反覆自然流產等臨床指征的情形適用。

PGD/PGS流程中，活檢實際上就是單細胞的收集。

在卵裂球期（D3）胚胎進行活檢，一般是單細胞，而在在囊胚期（D5-6）進行活檢則可以取出少量幾個細胞，一般都不足10個細胞。

活檢到的細胞有一定的隨機性，胚胎在發育的過程中也有自我修復特性，所以對於PGD/PGS一定要進行產前診斷。

目前行PGS/PGD檢測的技術有多種，比如FISH，多重巢式PCR，aCGH及NGS等。

隨著技術的發展，aCGH和NGS越來越多地應用在臨床PGS的檢測中。

而單細胞全基因組擴增技術對aCGH和NGS技術上的單細胞基因檢測影響很大，目前在PGS/PGD中常用的單細胞擴增技術有DOP-PCR（簡併寡核苷酸引物PCR）、MDA（多重置換擴增技術）、MALBAC（多次退火環狀循環擴增技術）等。

有研究顯示，比較幾種基因組擴增技術，DOP-PCR 和MALBAC 方法在拷貝數變異（CNV）的均一性上要好一些。

MALBAC方法對GC含量高的序列有擴增偏好，但通過生物信息學方法矯正後也可準確地分析拷貝數變異（CNV），對於GC含量較高的物種可以選擇該種方法。

MDA方法操作簡單，擴增隨機，對GC含量沒有偏好性，在SNP的研究中具有優勢，特別是在樣本量較少的情況下。

目前，越來越多的單基因遺傳病PGD也開始應用NGS的手段來檢測分析，因此在做PGD/PGS的時候一定要注意，胚胎到底要做什麼分析，在明確分析靶標和後期的檢測技術後，再來確定最合適的單細胞擴增技術，否則會給後期檢測帶來很多麻煩。

舉個臨床應用的實例，脊肌萎縮症是中國人當中攜帶率非常高的疾病，每40-60個中國人中有一個攜帶者，它是一種影響肌肉運動控制的遺傳性疾病，約95%的症狀由SMN1基因外顯子7的純合缺失引起。

我們用傳統的STR位點分析結合MLPA方法進行了家系檢測，明確家系的致病突變後，按夫妻要求行PGD，後又通過NGS的方法分析胚胎，兩種方法結果一致。

在我們實驗室，只要明確單基因遺傳病的致病突變都能通過傳統的多重巢式PCR手段完成PGD的胚胎篩選，同時大多數的單基因遺傳病也都可以通過NGS實驗檢測。

另一個應用單細胞檢測在優生領域的應用是無創產前檢測NIPT。

目前應用最廣泛的NIPT是利用母體外周血當中胎兒游離的DNA來檢測，但此檢測中畢竟存在大量母體DNA的干擾。

早在1969年就發現在母體外周血當中存在胎兒游離的細胞。

目前也有學者在嘗試用無創的手段從母體中篩選出胎兒細胞行遺傳學檢測，根據胎兒細胞的來源主要有三類，分別是母血當中胎兒的滋養層細胞，有核紅細胞，母體子宮頸滋養層細胞。

整個過程中最大的難點是對於單細胞的鑑定和分離，因為母源外周血當中，有核的紅細胞比例非常低，一毫升可能只能分離出一個細胞，分離很困難。

其次是胎兒細胞的鑑定，如何利用特異的marker對分離出來的胎兒細胞進行鑑定，再進行相應的檢測。

對比胎兒的游離DNA和胎兒的細胞，胎兒細胞的分離和鑑定相對更複雜，但是比胎兒DNA的應用更廣泛和直接，未來也許會應用於診斷，而胎兒游離的DNA主要還是篩查。

目前來看單細胞檢測在臨床中的實際問題有哪些？希望給企業界朋友一些參考。

我們在做PGS時發現，同樣一個樣本在不同的平台上檢測後的結果會不同。

所以如何統一分析的標準很重要，這也引出了PGS目前所面臨的問題，準確性問題、局限性問題、安全性問題，都是患者和醫生最關心的問題。

另外是性價比，目前高通量測序成本在逐年降低，但是臨床應用成本還是比較高，患者也一定會考慮成本問題。

目前，應用於PGS的平台包括華大（BGISEQ-500）、Illumina（MiSeq）、Illumina（NextSeq 500）Illumina:（Karyomapping 晶片）、Thermo Fisher（Proton）、Thermo Fisher（PGM）、aCGH （晶片）等。

最後談下單細胞技術的進展，2017年Science上發表了新的單細胞擴增技術LIANTI，能利用更為均一的線性擴增，提高單細胞CNVs檢測的解析度（from 1Mb to 10kb），降低單細胞SNVs檢測的假陽性率。

此外目前平衡易位攜帶者篩查在臨床上的應用還受到限制，雖然已有相關文章發表，但在臨床大規模應用還有很多附加條件。

針對單細胞基因檢測在優生領域中的發展方向，還有一些新的嘗試，比如通過數字PCR（ddPCR）手段進行唐篩，相比NGS成本更低、靈敏度更高還可以定量。