植入前胚胎遺傳學診斷及篩查技術與規範

植入前胚胎遺傳學診斷（preimplantation genet?ic diagnosis，PGD）是在胚胎著床之前即對配子或胚胎進行遺傳物質分析，選擇沒有遺傳物質異常的胚胎移植。

植入前胚胎遺傳學篩查（preimplan?tation genetic screening，PGS）是選擇染色體整倍體的胚胎進行移植，進而提高體外受精-胚胎移植技術（IVF-ET）的成功率。

PGD和PGS避免了以往產前診斷方式可能的治療性引產給母體帶來精神和身體上的創傷，受到了廣大生殖領域和遺傳領域專家們的關注。

1990年誕生了世界第1例PGD嬰兒［1］，至2004年，已經有超過1000個經PGD診斷的正常嬰兒出生［2］，到2010年，全球大約有10000個經PGD和PGS的嬰兒出生［3］。

1 PGD和PGS適應證

1.1 PGD適應證

1.1.1 單基因遺傳病和性連鎖遺傳病 世界首例PGD診斷的是X-連鎖隱性遺傳病，Handyside等［1］通過對胚胎性別的檢測，選擇女性胚胎移植，獲得成功的妊娠。

此後，PGD診斷了許多遺傳疾病，例如囊性纖維病、地中海貧血、脊肌萎縮症、亨廷頓病等等。

1999年，中山大學附屬第一醫院報導了中國大陸首例PGD。

單基因遺傳病PGD是經過遺傳學檢測致病基因，選擇沒有基因突變的胚胎移植，避免子代發病；而對於性連鎖的遺傳病來說，還可以通過對胚胎性別的鑑定，實現避免子代發病的可能。

然而，X-連鎖隱性遺傳病如果選擇男胚移植，雖然子代不會發病，但是理論上將有50%的男性正常胚胎被丟棄，50%的女性攜帶者胚胎予以保留。

1.1.2 染色體疾病 染色體疾病可以分為染色體數目異常和結構異常：例如47，XXX（克氏症）、Turner 綜合徵（45，XO）均是染色體數目異常；而相互易位、羅伯遜易位、染色體倒位等均屬於結構異常。

相互易位是指兩條染色體斷裂後相互交換無著絲粒斷片後重接，人群中發生率約為1/6×106。

羅氏易位斷裂發生在兩個近端著絲粒染色體著絲處，斷裂後兩長臂染色體的著絲粒互相融合形成一個衍生染色體，發生率大約為1/1000。

由於沒有重要遺傳物質的缺失，相互易位和羅氏易位又被稱為平衡易位，智力、表型通常正常，但是在生育時，由於產生不平衡的配子會導致生育力下降、復發性流產、畸形兒等問題。

通過PGD，選擇正常或平衡的胚胎移植，可以解決這類人群的生育問題。

螢光原位雜交（FISH）技術在染色體疾病的PGD領域內應用了十餘年。

雖然要根據不同的染色體疾病選擇探針、設計實驗方案，診斷的染色體條數十分有限，但是FISH操作簡便，為許多染色體疾病夫婦解決了生育問題。

近年來，隨著分子生物學技術的發展，越來越多的染色體疾病PGD採用了基因晶片或二代測序技術，這些新技術不僅可以檢測存在問題的染色體，而且可以檢測其他全部的染色體，提供更多遺傳信息。

1.1.3 人類白細胞抗原(HLA)配型 對於某些血液病患兒家庭來說，通過PGD可以進行HLA選擇與患兒相同配型的胚胎移植，來救治已有的血液病患兒。

但是，該PGD嬰兒因為其能成為「救治嬰兒」而誕生，其他胚胎因為無「救治功能」而被丟棄，這些尚有倫理爭議。

1.1.4 線粒體疾病 大約15%的線粒體或氧化磷酸化疾病是由母系遺傳的線粒體引起的DNA（mtDNA）突變。

因此，通過PGD，選擇mtDNA突變比率低於發病閾值的胚胎，可以降低子代發生疾病的風險。

1.2 PGS 適應證 PGS是以提高妊娠率、活產率為目的的胚胎篩查方法。

通過對染色體數目異常的篩選，選擇染色體整倍體的胚胎進行移植。

Munné等［4］在1993 年第1 次報導了對胚胎進行PGS，此後，該應用逐年增多，歐洲人類生殖和胚胎學( ESHRE)PGD 協作組報告2009 年的PGS 達到3551個周期［5］。

PGS的主要指征包括不明原因的反覆著床失敗、不明原因反覆流產、女方高齡等。

雖然對PGS的應用目前學術界尚存爭議，但是大多數學者主張摒棄卵裂期胚胎FISH進行PGS。

已經有許多研究結果顯示，通過PGS可以增加著床率、降低自然流產率、減少非整倍體胚胎妊娠以及提高輔助生殖技術的成功率；但是仍需要多中心大樣本的研究進一步證實。

2 植入前診斷和篩查的取材

取材是PGD和PGS的一個重要步驟，它不僅要保證所獲取的細胞能適用於遺傳診斷的要求，而且還要儘可能地降低取材對胚胎髮育的影響。

2.1 PGD的取材來源

2.1.1 極體 極體是卵母細胞的副產品，對胚胎髮育影響較小。

極體取材可以提供的遺傳診斷時間相對較長，有利於胚胎在新鮮周期移植。

但是，利用極體只能推測來自母親的遺傳信息。

2.1.2 分裂球 採用卵裂期胚胎的分裂球進行單細胞遺傳學分析，可以同時分析來自父母雙方的遺傳信息，是前些年PGD工作中最主要的取材來源。

但是，由於可供診斷的細胞有限以及卵裂期胚胎嵌合比例較高，目前分裂球取材所占比例在逐漸下降。

2.1.3 囊胚取材 囊胚期嵌合比例顯著低於卵裂期胚胎，囊胚的滋養層取材不僅獲得的細胞數目增多，提高了遺傳診斷的準確性，而且對胚胎損傷也相對小，近年來，越來越多的PGD和PGS周期採用了囊胚期取材技術。

當然，囊胚的培養技術、玻璃化凍融技術越來越成熟以及雷射儀器的發展也為囊胚取材廣泛應用提供了技術保障。

2.2 PGD的取材方法 胚胎取材是PGD過程的一個重要步驟，取材是否成功直接影響到PGD的最終診斷，同時取材的過程對胚胎而言是一項損傷性的操作。

取材包括透明帶打孔和細胞獲取2個過程。

透明帶打孔包括化學法、機械法、雷射法。

化學法由於Tyrode’s酸可能對胚胎有損傷，故目前很少採用；機械法雖然對胚胎損傷相對小，但是技術難度高，體外操作時間長，逐漸被雷射法取材所取代。

雷射法透明帶打孔指通過雷射發生器產生的雷射能量使局部透明帶熔解揮發，通過調整雷射能量、作用時間及脈衝次數來控制透明帶打孔的大小。

3 遺傳診斷技術

3.1 PCR技術在PGD中的應用 聚合酶鏈式反應(PCR)是利用一對寡核苷酸鏈做引物，引導DNA聚合酶在引物識別位點之間2條互補鏈上進行DNA合成，經過模板變性、退火及延伸3步為1個循環，每一循環的產物可以作為下一個循環的模板，多次循環可使特定DNA片段在數量上呈指數增加至可檢測範圍。

世界首例PGD即通過PCR技術完成的［1］。

由於PGD和PGS的診斷材料是1個或幾個細胞，DNA含量極少，很容易造成擴增失敗或者擴增偏倚，嚴重地限制了PGD和PGS的發展。

雖然許多學者發展了PCR的衍生技術，如巢式PCR、多重PCR、螢光定量PCR等，在一定程度上拓寬了PGD診斷的範圍，但是仍然十分有限。

近年來，單細胞全基因組擴增技術（whole ge?nome amplification，WGA）發展迅速，引領著PGD和PGS領域的大步前進。

WGA 是一種對全部基因組序列進行非選擇性擴增的技術，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加DNA的總量。

目前PGD和PGS領域中應用較多的WGA技術有：簡併寡核苷酸引物PCR（DOP-PCR）、擴增前引物延伸反應PCR（PEP-PCR）、多重鏈置換擴增（MDA）以及多次退火環狀循環擴增技術（MALBAC）［6］。

利用WGA產物進行基因晶片檢測或二代測序，是目前PGD和PGS領域內應用最廣泛的方法，後面將會詳細敘述。

單細胞PCR技術不僅對實驗室的要求很高，而且還存在一些問題，比如擴增失敗、污染以及等位基因脫扣等。

3.2 FISH技術在PGD和PGS中的應用 FISH是在一定條件下將用螢光色素標記的特異DNA探針和組織細胞中待測的特異染色體序列進行原位雜交，在螢光顯微鏡下對雜交信號進行顯示和觀察，從而進行診斷。

FISH在PGD中主要應用於性連鎖疾病和染色體疾病的診斷。

FISH技術雖然操作相對簡單，無需DNA擴增，但是FISH可以檢測的染色體條數有限（最多10~12條），需要根據需要檢測的染色體選擇不同的探針，而且有時信號判斷困難。

近年來，FISH技術逐漸被基因晶片技術和二代測序（next generationsequencing，NGS）技術所取代。

3.3 基因晶片技術在PGD和PGS中的應用 基因晶片技術可以同時檢測成千上萬個已知基因的多態性或突變。

目前，臨床上主要應用的基因晶片包括比較基因組雜交晶片（comparative genomic hy?bridization，CGH）和單核苷酸多態性晶片（single nucleotide polymorphism，SNP）。

CGH 是通過一次雜交對整個基因組的染色體拷貝數量的變化進行檢查，與正常人的間期染色體進行比較，再藉助於分析技術對染色體拷貝數量的變化進行定量研究。

SNP指的是DNA序列上發生的單個核苷酸鹼基之間的變異。

CGH和SNP技術可以檢測到更細微的染色體變化，比如>3Mbp重複和缺失均可以檢測到。

單細胞全基因組擴增技術與晶片技術的結合，可以檢測單細胞或微量細胞的染色體狀況。

因此，CGH、SNP晶片已經在PGS和染色體疾病PGD領域中廣泛應用。

3.4 NGS技術在PGD和PGS中的應用 NGS是相對於傳統的Sanger測序而言的。

NGS改變了測序的規模化進程，其技術特徵是不再區分單一模板，而是將模板變成了「庫」，包括了需要測序的所有模板，同樣是根據模板序列合成或者雜交形成互補鏈，通過互補鏈的延伸過程中引入的螢光標記來識別每個鹼基。

自2008年以來，全基因組測序費用呈指數級下降，這也是NGS能夠進入PGD和PGS臨床應用的一個重要條件。

提到NGS，我們還要提到一個重要的名詞：測序深度。

所謂測序深度是指測序得到的鹼基總量（bp）與基因組大小的比值，通俗地也可以理解為將基因組測了幾次，它是評價測序量的指標之一。

測序深度與基因組覆蓋度之間是一個正相關的關係，測序帶來的錯誤率或假陽性結果會隨著測序深度的提升而下降。

NGS進行PGD和PGS也分為2種類型：一種是先將取材的細胞進行WGA，然後再進行NGS，這也是比較常見的方式。

另一種是取材的胚胎細胞無需WGA，而是利用模仿PCR技術擴增大量的特異性片段，然後這些擴增的片段再進行NGS。

2013 年的ESHRE 年會上，Wells等［7］匯報了NGS-PGS妊娠成功的病例；同年，華大基因與湘雅醫院也報導了NGS 檢測囊胚的PGS 成功病例［8］。

隨後，多篇相關研究相繼發表。

NGS技術不僅在PGS中應用，通過測序深度的調整，NGS也在PGD領域內開始應用。

2013年，Treff 等［9］對6 例夫婦（囊性纖維化2例，Walker-Warburg綜合徵、家族性植物神經功能障礙症、X-連鎖低磷性佝僂病、神經纖維瘤各1例）進行PGD診斷，遺傳診斷技術分別採用其他實驗室、qPCR和NGS技術分別來診斷。

結果顯示NGS的診斷結果與其他兩種方法完全一致。

2014年在北京大學第三醫院生殖中心誕生了世界首例和第2例MALBAC擴增測序的PGD嬰兒，分別診斷了遺傳性多發性骨軟骨瘤和X-連鎖少汗型外胚葉發育不良。

NGS技術在PGD和PGS領域中的應用正在逐步發展，NGS技術最大的優點還在於它不僅可以檢測胚胎的非整倍性，而且可以檢測單基因疾病。

這是其他技術尚不能達到的。

4 倫理學思考

雖然PGD和PGS可以避免常規產前診斷所帶來的人工流產或引產，但在實際臨床應用中，該技術仍然存在許多問題值得重視。

PGD和PGS是通過對胚胎進行侵入性操作獲得最終診斷，對子代需要長期大樣本的隨訪。

此外，PGD過程中，胚胎的棄留也存在許多爭議。

比如，對於X連鎖的隱性遺傳病進行性別篩選時，將有一半的健康男胚被丟棄，還有一半的女性攜帶者胚胎被保留；而對於常染色體隱性遺傳病來說，雜合子胚胎是否進行移植也一直存在爭議。

對於PGD的一些指征，也一直存在爭議，比如一些家族性腫瘤(如家族性結腸息肉病、乳腺癌等)的易感性分析、HLA選型來救治已有的血液病患兒等等。

值得重視的是，PGD之前的遺傳諮詢十分重要。

ESHRE對他們收集的2009年PGD數據分析，PGD的平均妊娠率只有23.04%［5］。

因此，醫生應該客觀地交待PGD過程及結果，而不是過分誇大其成功的結局，這樣會更受到患者的青睞。

要清楚地告知夫婦PGD的誤診可能，同時，也建議夫婦如果妊娠後應該進一步做常規產前診斷。

PGD的診斷不應隨著胚胎移植入母體而結束，而要繼續隨訪至產前診斷乃至對日後出生的嬰兒也應該繼續隨訪。

Kalfoglou等［10］的調查表明，即使PGD誤診，最終導致致病嬰兒出生，醫院對其隨診也將明顯改善患者的滿意度。

綜上所述，單細胞的遺傳診斷技術日新月異，引領著PGD和PGS領域快速前進。

如果說1978年LouisBrown的誕生劃時代地開啟了人類輔助生殖技術的新篇章［11］，那麼單細胞遺傳診斷技術的飛速發展則為許多存在著遺傳疾病高風險的夫婦帶來了福音與新的希望。

近年來，歐洲和美國都相應制定了PGD和PGS的技術指南或建議，我國衛生和計劃生育委員會也發布了《關於輔助生殖機構開展高通量基因測序植入前胚胎遺傳學診斷臨床應用試點工作的通知》，相關部門也已經著手制訂詳細的技術規範。

隨著單細胞遺傳診斷技術的不斷發展與完善，相信越來越多存在著遺傳疾病高風險的夫婦將會從中受益。

參考文獻

［1］ Handyside AH，Kontogianni EH，Hardy K，et al.Pregnancies from biopsied human preimplantation embryossexed by Y spe?cificDNA amplification［J］.Nature，1990，344:768-770.

［2］ Verlinsky Y，Cohen J，Munne S，etal.Over a decade of preim?plantation genetic diagnosis experience – a multi- center re?port［J］.Fertil Steril，2004，82:292-294.

［3］ SimpsonJL.Preimplantation genetic diagnosis at 20 years［J］.Prenat Diagn，2010，30:682-695.

［4］ Munné S，Lee A，Rosenwaks Z，et al.Diagnosis of major chromo?some aneuploidies In human preimplantation embryos［J］.Hum Reprod，1993，8:2185-2191.

［5］ Moutou C，Goossens V，Coonen E，etal.ESHRE PGD Consor?tium data collection XII: cycles from January to December 2009 withpregnancy follow- up to October 2010［J］.Hum Reprod，2014，29: 880-903.

［6］ Yu H，Wei F，Liying Y，etal.Genome analyses of single human oocytes［J］.Cell，2013，155:1492-1506.

［7］ Wells D，Kaur K，Grifo J，etal.A novel embryo screening tech?nique provides new insights into embryo biology and yields the firstpregnancies following genome sequencing［J］.Hum Reprod，2013，28(Suppl 1): i25-27.

［8］ Yin X，Tan K，Vajta G，etal.Massively parallel sequencing for chromosomal abnormality testing introphectoderm cells of hu?man blastocysts［J］.Biol Reprod，2013，88:69.

［9］ Treff NR，Fedick A，Tao X，etal.Evaluation of targeted next-gen?eration sequencing-based preimplantation genetic diagnosis of monogenicdisease［J］.Fertil Steril，2013，99:1377-1384.

［10］ Kalfoglou AL，Scott J，Hudson.PGD patients』and providers』 at?titudes to the use and regulation ofpreimplantation genetic di?agnosis［J］.Reprod Biomed Online，2005，11(4):486-496.

［11］ Edwards RG，Steptoe PC.Birth after the preimplantation of a hu?man embryo［J］.Lancet，1978,312:366.