喬傑：生殖遺傳學進展及單細胞測序的應用研究

2015中國遺傳學會大會於8月14日在雲南昆明正式開幕，大會主題「遺傳多樣性：前沿與挑戰」，本次會議是中國遺傳學會的學術交流大會，是全面展示中國遺傳學研究的最新進展的學術盛會。

北京大學第三醫院院長喬傑教授作了題為「生殖遺傳學進展及單細胞測序的應用研究」的大會報告，重點講述了PGD/PGS的必要性、臨床應用，以及最新應用於生殖醫學領域的MALBAC技術，並對其未來發展做了預測。

喬傑院長表示，在臨床應用中，染色體核型分析檢出率低並且不能明確異常染色體來源，局限了其大規模使用。

MALBAC技術是謝曉亮教授研究組創建的一種新的人單細胞全基因組測序技術，它具備準確性高、基因組擴增均勻且覆蓋率高、能檢測單個細胞中與遺傳疾病相關的染色體異常和DNA序列變異、可用極體進行測序等技術優勢，已成熟應用與生殖醫學領域。

最後，喬傑教授對PGD的發展進行了預測，她表示，與單細胞發展歷程相似，表觀遺傳學正成為主流。

在下一個PGD新技術的出現也許來自表觀遺傳學。

以下為演講文字實錄：

我們所有起重要功能的蛋白、DNA到基因，從生殖來說，生殖遺傳對於臨床和基礎的結合是在逐漸發展的過程，從遺傳學上，從群體遺傳，細胞遺傳，分子遺傳，藥物遺傳等等，後邊輻射出目前在研究中的、從微觀到宏觀等一些跟遺傳相關的。

歸根到底，我們是希望有一個好的方法去告訴我們的遺傳診斷，從細胞遺傳學的檢測到分子遺傳學的方法到我們現在的比較基因組雜交方法的檢測，那麼這些方法是隨著我們各項技術的發展逐漸可以在人類的遺傳學診斷上應用的。

像Down Syndrome到後來我們能夠從染色體檢查中就能發現，那麼從發現到我們怎麼樣能夠在中孕期把他阻斷，再到我們怎麼樣能在胚胎期就把它查出來，不讓婦女去承受中孕期流產或者出生以後家庭要去承擔一個沉重的負擔，對於社會來說，撫育一個Down Syndrome的孩子可能花費大概在100萬左右。

對於一個家庭來說，絕對不是100萬這個錢的數字，更是精神上的痛苦。

所以生殖遺傳就有了越來越重要的意義。

而回歸到總體的人類生殖，近年來，總體生育率的下降是非常的明顯。

不孕不育和心腦血管疾病，癌症並列成為了目前影響人類健康的三大疾病。

它又是一個特殊的缺陷，除了對於身體健康和家庭影響之外，它實際上更多地還影響到了一個社會總體的和諧。

而流產和出生缺陷同樣是嚴重的問題。

這三個加起來對於出生人口的質量的影響是非常大的。

所以我們醫生所看到的還只是冰山一角，可能有更多地要去做。

這是每天早上在我們生殖醫學中心前面排隊的人群，這張照片是我們在5月11號拍的，就是母親節的那一天。

大家都在享受母親節的快樂的時候，這些家庭只為了一個非常簡單地目標，就是去成為母親，在就醫的路上奔波，非常不容易。

那人類生殖輔助技術有了以後，確實是給這些家庭帶來了福音，基礎研究起了很重要的作用。

從1959年到1978年，兔子第一例體外受精的成功到人的第一例的成功經歷了非常漫長的歲月。

而人成功之後，到能夠非常成熟地在臨床上應用，同時在應用的過程中又有各種適用於不同疾病的延生技術的誕生。

那麼也是經歷了不斷發展的過程。

那麼非常重要的呢是到現在為止600多萬的試管嬰兒誕生了。

但是，我們可以看到，至今為止它的成功率，我們報的成功率為40%左右。

而這個成功率是什麼，是我們的臨床妊娠率，叫clinical pregnancy rate。

也就是說，超聲波看見婦女的體內有一個懷孕的孕囊了叫臨床成功。

但對於一個家庭來說，他所需要的是生育一個健康的孩子。

那真正的活產率，活的健康的孩子的出生率只有30%左右。

所以這樣一個問題的存在，關鍵呢是對人類生殖的認識還是比較少的。

那麼精子卵子受精的過程，受精以後呢怎樣去植入，這個胚胎的質量怎麼樣，非常的重要。

所以這個種子，土地，微環境這三個是影響整個人類生殖最重要的幾個方面。

那麼1978年誕生的是常規的體外受精胚胎移植。

就是把精卵放在體外，成了胚胎了，那麼給他種回去。

1992年就有了植入前的遺傳學診斷，它的適應症呢是單基因的遺傳病，染色體病和可能生育危險患兒的人群。

但是從1990到現在呢有很漫長的一個發展過程。

實際上呢就是在生殖遺傳上的認識受了很多的制約。

尤其是因為人類的胚子和胚胎是非常少的細胞，所以這個技術受非常大的影響。

所以我們可以看一看中國的這個數據。

2009、2010、2011年，我們的活產率只有31%-32%。

那麼這兩年的數據沒有出來，實際上還是這樣一個數據。

而常規體外受精（僅僅處理了精子，然後把有活力的精子打入體內的這樣一個技術呢）其實只有10%的活產率。

那麼對於供精的人工受精，就是用了好的精子，不是有問題的精子，這個成功率能有20%。

把胚胎冷凍之後也能達到30%的成功率。

那麼我們對比一下國際上的進展，我們拿美國為例。

從治療量上面來看和我們中國去比，它現在比我們少大概10萬左右的治療量。

所以中國現在是需要接受生殖輔助技術治療和能夠治療的都是量最大的一個國家。

那這個數據顯示的就是不同情況下的成功率，我們看深藍的這個標記就是常規的、俗稱的試管嬰兒的，我們叫新鮮的正常情況下我們用自己的精子卵子的成功率。

那麼在美國，它這是4個，下邊標註的96是它生殖中心一年所做的數目，做的量是相對比較小的。

而我們國內呢，大的中心大概是做一萬例一年，小的中心做三五百例，那是最小的了，做三五千例的是中等的。

所以現在國內總體上在臨床治療的水平上是比較高的。

那麼我們看到它各種治療周期數，因為考慮到治療周期數太少可能會影響質量，但總體上還是差不多的。

那剛才顯示的中國全國的數據，我們的活產率在31%，所以說應該跟國際的水平目前是持平的。

所以不管是中國還是世界，我們看到我們治療的成功率只有30%左右。

這個是WHO在2005年提出的策略，希望在2015年人人享有生殖健康。

那麼當時也是我們生殖學會成立的時候。

而這十年過去了，我們離人人享有生殖健康這個目標差得太遠了，影響的因素是非常非常的多。

那麼其中呢有遺傳的問題，有環境的問題。

那我們的技術是在不斷地發展。

而植入前遺傳學診斷呢逐漸地有了更好的技術的運用。

應該為治療，為提高成功率，為提高生育一個健康孩子的成功率提供了一個有利的技術和條件。

所以植入前遺傳學診斷PGD逐漸過渡到PGS Screening。

同時我們用新的技術，單細胞測序技術可以把PGD,PGS結合在一起，就更有利於相對用一個細胞拿出來做診斷去給一個胚胎一個定義這樣的辦法。

那麼PGD和PGS用於遺傳學的診斷和篩查主要也是根據診斷方法的不同，能夠做單基因的診斷，或者染色體的數目，或者染色體的結構，隨著技術的發展，能夠診斷的內容越來越多。

總體上PGD PGS的必要性它是跟因為胚胎的遺傳改變相對的比較多。

那麼從染色體的結構上，不管是數目的異常，結構的異常。

從基因突變上，不管是單基因多基因，同時有線粒體遺傳，表觀遺傳，所有的這些都是與出生缺陷有關係的。

而除了這個整倍體，三倍體，四倍體這個胚胎一般來說不能存活之外，其他都是有存活的可能性。

那就給未來的流產，出生缺陷帶來了可能性。

所以呢PGS,PGD的重要性就是有可能在植入前把這個胚胎做一個診斷，那麼避免後來的引產，出生缺陷的一些風險。

而在這個過程當中，我們對整體的，胚胎髮育的過程的遺傳，表觀遺傳和基因表達的精細調控的認識就變得特別的重要。

那前面談到的這個必要性裡邊呢，在這顯示的，染色體異常比例是比較高的，有百分之三十，百分之七十。

在卵裂期的胚胎，我們在體外看到的也只有40%的幾率能夠發育成囊胚。

所以我們在輔助生殖技術的研究過程中呢，因為在體外培養的時間過長，要求的接近人類自然培養環境的要求就越高。

剛開始，我們是兩天的胚胎移植，後來三天的胚胎移植，因為越在體外的培養時間長，我們能篩選出更多的胚胎來。

但同時，如果體外培養的條件不好，也會對胚胎造成更大的影響。

所以每一個技術在人類應用的時候利和弊都要做充分的考量。

那麼現在呢，總體上囊胚培養的技術比較好了，可以培養到5天，6天，那麼篩選出相對更好的胚胎。

那麼即使是在目前的技術上也只有40%左右的幾率能夠發育成囊胚。

那麼如果有了囊胚，我們在生物診斷技術當中就有個更好的，可能不止一個細胞，可能有三四個細胞。

而在卵上，我們只能做集體的活檢。

在胚胎期只能拿一個細胞。

如果拿多個細胞的話，對他的全能性的影響還是影響比較大。

那麼即使拿一個細胞，在我們Day 3的時候，胚胎6到8個階段，取一個細胞，我們現在發現影響比較大，所以目前做囊胚是最好的。

那麼從技術上呢最開始是PCR單細胞來做單位點突變的研究。

那它的問題是相對的費時，同時，等位基因的脫扣率是比較高的。

1992年呢，FISH是對於少數染色體可以做了，但是也有顏色的問題。

那麼Array CGH/SNP有了以後呢，能夠做全體染色體數目和結構異常的一個相對的篩查。

所以從PGD可以增加到PGS Screening這樣一個過程。

而近年來的一個高通量的測序在單細胞領域裡面的應用應該說是能夠同時去診斷單基因病和染色體疾病的開端。

我們也期望在發展的過程當中，更進一步地去精確診斷的技術。

因為對於胚胎來說，即使是2%、5%這樣的誤差，如果是這樣的孩子出生，大家都可能想像的到，你做一萬例，即使是10個孩子出生，對這些家庭來說也是非常沉重的負擔。

所以在人類應用的時候我們都是要期待更加精細化。

所以對於精準醫學在生殖醫學的討論可能更多的我們是說，我們一直都在路上，在做著這個工作。

那麼細胞遺傳學的方法是我們用的最多的，那它的缺點呢就是要細胞培養，周期長，人工耗費的也大。

同時微缺失是不能檢測的。

所以制約了產前診斷的開展。

那麼這個核心分析做為非整倍體診斷的一個新標準，我們至今還在用，但是在單細胞上，這個核型分析是比較困難的。

而分子遺傳學的發展包括PCR技術的發展，都給我們這樣一個機會，但是對於等位基因脫扣，對於PCR這個診斷技術難以克服的話，對於我們未來的應用是有影響的。

所以數字PCR的應用到原位的FISH雜交，到單細胞FISH的應用，再到FISH去篩查非整倍體的精子，那麼到比較基因組技術，實際上在這樣一個發展的過程當中，對於單細胞的應用都給了一個特定的機會，整體應用在比如說腫瘤的研究，血液系統的研究之後，逐漸應用到我們這個單細胞的技術當中。

對於Array CGH和SNP在生殖遺傳領域的應用，我們的實驗流程跟其他都是一樣的，那麼我們首先做的是臍血啊，染色體啊，羊水這樣的一些研究之後，我們就逐漸過渡到單細胞的應用上。

那麼不管是在總體的應用和單細胞的應用上，核心分析和SNP都有相應的問題。

這是我們臨床中碰到的，和正常的男性相比，和正常的女性相比，綜合下來，相對的不一致性。

不管CGH，SNP，我們拿它來和我們現在叫的新一代測序技術NGS去相比，他們都是有利有弊，即使是新一代的測序技術，大家也在提高，對臨床上來說，我們要求第一就是精度是最好的，拿等位基因脫扣率作一個代表來說，如果這個脫扣率高，那麼在單細胞擴增過程當中擴增的誤差大，對於我們的診斷呢影響就會多。

第二個我們要求的就是耗時，如果時間長，像48小時，那這個胚胎在體外沒法繼續培養了，必須把它冷凍起來，等你都做完診斷以後再把它解凍，再去移植。

而這個胚胎是經過活檢以後的胚胎，活檢以後的胚胎再冷凍再解凍，目前看成功率還是可以的，只敢這麼說，因為對人類的影響來說短時間，我們現在從追蹤、隨訪到出生，實際上對於一個總體可能的影響，我們要追蹤到他四十歲、六十歲、八十歲，要看各種，比如說我們做這個胚胎活檢的影響，我們在老鼠身上就發現它可能在老鼠到青年或中年的時候走迷宮的能力下降，那我們認為它認知能力下降，把它的腦子拿出來做研究，我們發現它一個神經髓鞘蛋白有問題，那人身上會不會有問題呢？我們現在PGD做過胚胎活檢的孩子才只有十幾歲、二十歲，但是剛才我為什麼那麼感興趣問賀林院士您是怎麼做腦子的基因測序啊，因為我們沒有辦法拿做過PGD胚胎活檢的孩子的腦組織去研究他的神經髓鞘蛋白是不是有問題，他到四十歲、六十歲會不會有老年痴呆，如果他會有的話，那我們這個技術可能就不適合在人類身上廣泛應用，因為每個技術你在給病人應用的時候一定要考慮利和弊，你能解決的問題和你可能給他帶來的問題是什麼，所以有效性和安全性一定是我們要考慮的最重要的兩個方面。

所以高通量測序技術用於胚胎染色體篩查呢，我們花了很多精力，在國際上不同的組織、通過不同的方法都去在研究，就是希望這個擴增的準確性要好，誤差會低一些。

那麼對於高通量測序我們用比較低的測序深度就能夠做染色體整倍性的測序，那麼這個已經是可以的了。

我們和謝曉亮教授剛才介紹的我們在《Cell》上發表文章，用這種MALBAC擴增技術，它這個技術就是一個相對的到目前為止在擴增上最準確最高效最經濟的一個胚胎篩查的技術。

那麼同時我們經過二次創新呢，能用統一細胞把染色體的篩查和單基因的診斷都做了，那麼就減少了我剛才說的取材的創傷性大，能夠在最小創傷的情況下去做相對最多的信息量的診斷，這個就是比較需要的。

那這張片子顯示的是我們做PGD 15年後的一個總結，現在看這一個回顧，總體上對我們目前所應用的一些技術，都各自有優點有缺點，還需要做更多的探索。

我們對NGS寄予更多的希望，因為相對來說它的解析度、有效性都是比較好的，儘管它的儀器設備的費用還比較高，但是每一個測定成本的降低還是能讓更多的病人享受到這樣一個好處，所以我們在臨床上病人捐贈我們的胚胎上，我們進行了對新方法和老方法擴增測序的一個比較，一個是看不同細胞之間有沒有差別，一個是看不同方法之間有沒有差別。

現在看呢，總體上就是在卵裂期的胚胎去做活檢的話，臨床上卵裂期一般是3天,6-8個細胞的時候，細胞的嵌合型是比較強的、嵌合率是比較高的，用哪一種技術來影響呢並不是特別大。

用三種技術進行檢驗做了一些對比，總體上也有差別，每一種技術目前還都完善，這也是我們不斷在追求新的技術去更完善的原因。

在臨床上呢，我們現在得出的結論就是Day 3的胚胎是不太好的，而用Day 5的囊胚期，因為囊胚我們取的細胞可以多兩三個，不同部位的自養細胞我們做了一個研究，還是相對的都能夠代表內細胞團，代表率能夠有百分之九十九點幾，這個還是相對可靠的。

所以我們跟病人交代也只敢交代相對可靠，依然會有不到1%不能代表內細胞團，同時等位基因脫扣率，雖然用了MALBAC比PCR明顯減少，但依然也還會有這樣1%-2%的脫扣率，所以還在研究更好的方法去做這個探索。

我們看到在Cell上不斷發表應用單細胞測序技術在不同的腫瘤上進行的研究，之後我們用MALBAC技術在人類精子上做的研究，之後就用卵子做的研究。

那麼MALBAC技術最大的一個好處就是利用一個特殊的引物使擴增子的結尾互補成環，這樣就防止了DNA的指數擴增，解決了擴增的偏移問題，同時也能夠保證用一個單細胞大概有90%以上的基因組擴增率的覆蓋幅度，所以這樣一個技術在臨床上應用以後還是一個比較好的，特別是對於集體，因為在一個卵母細胞取出來的集體還是非常小，在過去的擴增技術上使用起來是比較困難的。

現在我們就把集體活檢和囊胚的活檢結合起來，對於母原的遺傳病就有一個double confirm的作用。

我們和兩個項目組合作，謝曉亮項目組和湯富酬項目組，這些新的方法給我們各個領域都提供了一個更好的研究空間。

那利用單細胞的轉錄組、甲基化組和環形RNA技術，我們在胚胎研究上也是在不斷深入，那謝曉亮的這個年度方法在Nature Methods上報導以後可以看到一個更多的應用。

我們在臨床上應用幾個病例都非常成功，這個病例就是一個X-連鎖外胚層發育不良，她現在有一個孩子是7歲，沒有汗腺、沒有毛髮、不能坐立，智力也不到1歲，所以這個家庭是迫切需要生育一個健康不攜帶致病基因的孩子，那我們用這樣一個方法給她做了集體和囊胚期細胞的聯合活檢，這個孩子已經出生了，觀察到現在也是非常好，也是正常的孩子。

第二例是一個多發性軟骨瘤，他就是骨頭上，大概100多塊骨頭不斷地在長瘤子，不是惡性的，但是在他的一生當中不斷地需要手術，走路也是跛型，頸椎在她生育這個健康孩子之前也做了手術，所以對她來說是很痛苦的，她在了解到這樣一個技術之後她就要求能不能她自己來做這個實驗，實際上她這個用單細胞PCR測序是可以解決的，因為他爸爸的情況並不重，他的情況重，他認為有新發突變，所以她就希望你們能不能有新的技術幫我儘可能的選一個我的孩子不會再比我更嚴重，所以我們就用她的胚胎給他做，確實發現她有新發突變，也有一些染色體異常的，如果在過去我們只能篩出他染色體異常的和新發突變分開做，只能做一種，那對她來說就只能做她原來那個突變，我們現在新的方法是把她的染色體異常和新發的突變都給她去掉，新發突變是不是有意義，其實我們並不知道，但是我們把這個胚胎留著，至少在目前我們的知識上給她檢查出來既沒有她目前有的單基因病，同時也沒有新發突變，同時也沒有染色體異常，就給她移植回去了，他是比第一例早出生的，9月19號就出生了，現在孩子也很正常。

所以這個技術在臨床上是能給這些病人帶來很大益處的，我們也逐漸在對比新舊方法能給病人帶來哪些好處。

但是因為深度測序給了更多的information，那麼多的information對於一個胚胎的判斷起哪些作用，我們現在非常慎重，都只在研究階段，因為這些信息並不能夠判斷一個胚胎也就是一個人的生死，所以儘管對於這種嚴重的致死致殘的遺傳病會給他選擇一個健康的胚胎，一般的疾病還是不建議做遺傳學診斷的篩查，因為有更多的倫理學問題，但是這個技術用來做研究和對未來更多的探討還是非常有意義的。

比如說我們用這個MALBAC來做人類卵母細胞減數分裂過程中染色體重組的研究就非常有意義，這個發表在Cell上面，因為克服了幾個困難，一個是第一極體、第二極體都能取出來，卵母細胞核也要正常，後面它也要正常的分裂，在這個過程中，我們是拿這樣一個活檢的單細胞做了183個細胞的測序，發現用第一極體、第二極體來推斷卵母細胞核，過去我們只拿第一極體做診斷，發現還是有一些異常，不能夠完整地代表卵母細胞核，現在通過第一極體、第二極體雙檢查能夠完整地推斷卵母細胞核。

拿病人捐贈的這個做了判斷後，我們就可以在臨床上進行應用，這個利用單倍體的第二極體進行基因組分型也是特別有意義的。

所以通過這樣一個研究，對於極體測序在植入前診斷中的應用除了實現卵母細胞和極體的單細胞測序之外，對於準確的判斷雌核的意義、對於遺傳病就是對於單細胞位點突變，可能能夠三重確定一個胚胎健康與否，那麼通過連鎖分析能夠除外更多可能的發生就特別有意義了。

同時我們現在最新做的就是只用0.01X的測序就能夠達到很好的23對染色體的篩查，信號也很穩定，這樣胚胎診斷的成本就可以降到七八百塊錢，這個在臨床應用也是非常有意義的。

那我們把它和目前應用的比較基因組雜交和SNP進行對比，現在晶片在國內賣差不多要兩三千塊錢，再加上機器的價錢，這個成本還是非常高的。

這個研究發表之後Nature和BBC News等都進行了一系列報導，因為對這個期望值很高，希望能夠提高這些疑難輔助生殖技術的成功率，同時無創的卵母細胞的基因檢測，那麼這些分析就都非常重要。

這個孩子的出生可以說給更多的遺傳病家庭帶來了希望，，那麼當時正好是總書記和劉延東副總理五四節的時候到北大去對於科技創新希望給予更多的鼓勵，我們也特別介紹了目前國家在生殖遺傳、生殖健康中所面臨的問題，特別是流產和出生缺陷，也希望國家給予更多重視，那我們要開發更多新的方法和基因檢查，期望達到的目的是覆蓋度還要廣、還要準確、價格還要可以接受，同時操作也要更簡便。

所以這樣一個單細胞測序在基因組學的研究上應該是現在在世界上被廣泛承認，也已經在臨床上應用的。

另外就是對於表觀遺傳，表觀遺傳的研究逐漸地能夠過渡到單細胞對於生殖遺傳去應用的話也是基於單細胞表觀遺傳測序技術的發展，湯富酬教授做的這個，有了這個技術以後首先是在胎兒的腦細胞，就是流產的胎兒，我們徵得了病人的同意做的這樣一個人的基因組的研究，同時還有車禍的人捐贈的腦組織，我們做的相關研究，然後對於技術有了進一步的發展，同時國際上其他同道也在不斷報導，我們在2013年對於早期胚胎的DNA延展計劃圖譜做了一個詳細的描述，這個圖譜描述出來以後，應該說是比較好的勾畫出來了一個從配子-精子-卵母細胞，再到胚胎，再到早期的胚胎，我們今年6月份新發表的這一篇文章是對於早期的生殖細胞的一個研究，我們期望的是這樣一個基礎的研究出來了整個一個人類胚胎髮育的表觀遺傳我們重要的是和未來的聯繫，就是人類的一些跟表觀遺傳相關的疾病在胚胎期是怎樣的一個影響，同時我們體外受精這樣一個技術會不會對表觀遺傳產生的比如說代謝綜合徵，我們現在發現成人的代謝綜合徵是明顯增加的，跟環境因素關係很大，但是現在看跟遺傳的關係也是比較大的。

而我們輔助生殖技術出生的孩子追蹤到現在，因為現在第一例試管嬰兒是37歲了，我們中國大陸的第一例試管嬰兒是27歲，這個孩子在我們這裡工作，也有一點肥胖，那麼國際上報導的目前出生的這些孩子裡的代謝綜合徵的發生率是增加的，那麼它的這個增加跟遺傳肯定是沒有關係的，那麼跟表觀遺傳是什麼關係？是在胚胎髮育的哪個階段？是體外培養的？還是在孕期，母親的營養方面？那我們要去研究它可能發生的相關因素，給予阻斷，可能會產生更好的一個影響。

所以生殖遺傳應該說還是一個相對的需要更多其他技術去結合起來、多學科合作、能夠探索。

首先是人類生殖的奧秘，然後我們才敢說跟臨床線下的聯繫、跟臨床疾病的聯繫，討論這些可能的機制，再到臨床上去做診斷和應用。