特定蛋白項目的臨床應用與檢測的質量控制

檢驗醫學——中華檢驗醫學網旗下微信公眾平台。

您的隨身微雜誌。

目前已用於臨床診斷的特定蛋白多達40~50種，涉及免疫球蛋白及補體系列、風濕及類風濕系列、尿微量蛋白系列、急性炎症蛋白系列等。

通過專業的特定蛋白分析儀或生化分析儀對其分析，為臨床提供有效的病理生理指標，並作為臨床診斷、治療效果和分析預後的依據。

血漿蛋白成分至少有1000多種，已分離出的具有臨床意義的純品有100多種，其中許多蛋白具有特定的抗原性，可以採用抗原抗體反應的方法，對血液、腦脊液、尿液等標本中的這些蛋白進行檢測，故習慣稱其特定蛋白。

這些特定蛋白在機體內具有某種生理功能，當疾病狀態時又具有重要的病理意義。

目前可以通過專業的特定蛋白分析儀或生化分析儀對其分析，為臨床提供有效的病理生理指標，並作為臨床診斷、治療效果和分析預後的依據。

一、特定蛋白項目的臨床應用

目前已用於臨床診斷的特定蛋白多達40~50種，涉及免疫球蛋白及補體系列、風濕及類風濕系列、尿微量蛋白系列、急性炎症蛋白系列等。

主要分類及其臨床應用如下：

1. 免疫球蛋白及補體系列：IgG、IgM、IgA、補體C3、補體C4、IgG、IgA、IgM的檢測有助於了解機體抗感染能力。

在免疫複合物疾病中，C3、C4檢測可以了解其消耗程度。

適應症：①免疫力低，反覆感染患者；②自身免疫性疾病；③多發性骨髓瘤；④慢性肝病；⑤非何杰金氏淋巴瘤；⑥白血病；⑦良性單克隆免疫球蛋白病；⑧先天性或獲得性低免疫球蛋白血症；⑨對白、球蛋白比例異常者；⑩術後感染，移植排斥反應。

2. 風濕及類風濕系列：抗鏈球菌溶血素(ASO) 、類風濕因子(RF) 、C-反應蛋白(CRP)RF是抗變性IgG的抗體，常見於類風濕性關節炎患者的血清和滑膜液中，其定量測定是判斷患者免疫應答和觀察療效的一個重要指標。

CRP對類風濕炎症反應具有輔助的診斷作用。

ASO可用於風濕熱和風濕性關節炎的鑑別診斷。

適應症：①風濕性疾病；②類風濕關節炎；③骨關節炎與類風濕關節炎的鑑別。

3. 尿微量蛋白系列：尿微量蛋白(MA)、尿轉鐵蛋白(TRU)、尿免疫球蛋白(IgU)、α1-微球蛋白(A1M)、β2-微球蛋白(β2MG)腎小球性蛋白尿是由於腎小球濾膜通透性增加或(和)濾膜上負電荷減少所至。

如果尿蛋白排出增多，但低分子量蛋白為主，如MA、TRU等，稱為選擇性蛋白尿；若高分子量的蛋白排出增多，如IgU等，稱為非選擇性蛋白尿，後者表示病變嚴重。

腎小球性蛋白尿可見於腎小球腎炎、糖尿病、自身免疫性疾病和腫瘤等。

腎小管性蛋白尿系腎小管重吸收功能障礙所致，主要是小分子蛋白排泄增高，如β2MG、A1M。

可見於腎孟腎炎、失鉀性腎病、腎血管性疾病及重金屬中毒等。

適應症：①病程超過5年的胰島素依賴型糖尿病患者；②糖尿病合併高血壓患者；②肥胖型非胰島素依賴型糖尿(NIDDM)患者；④接觸腎毒性物質，接受腎毒性藥物治療的患者；⑥可疑腎病或有腎病危險因素的患者。

4. 急性炎症蛋白系列：C-反應蛋白（CRP）、α1-酸性糖蛋白(AAG) 、觸珠蛋白(HPT) 、銅蘭蛋白(CER) 、α1-抗胰蛋白酶(AAT)在炎症和組織壞時，血漿某些蛋白會出現特徵性變化，稱為急性炎症時相反應。

CRP、AAG、HPT、CER和AAT是五種急性炎症時相蛋白，其在急性損傷早期就可表現出含量升高。

這些指標比傳統指標如發熱、白細胞升高及分類異常、血沉加速等，能更早的反映炎症和感染情況。

另外，急性炎症時相蛋白增加的持續時間不一樣，有助於準確判斷炎症的發展過程。

其中CRP最為敏感，在炎症發生的最初2小時內含量就會增加；HPT在48小時內明顯升高；AAG是疾病恢復的極好指標；而CER經常與HPT、AAG一起檢測，有助於對急性炎症時相反應的監測。

5. 多發性骨髓瘤檢測：κ-輕鏈(KAP)、λ-輕鏈(LAM)游離輕鏈又稱本周氏(Bence-Jonese)蛋白，是由漿細胞無性繁殖合成，它分為KAP型和LAM型兩類。

游離輕鏈與骨髓瘤的關係最密切，約20％的骨髓瘤患者只分泌游離輕鏈，約50％的骨髓瘤患者既分泌免疫球蛋白，又分泌游離輕鏈，而前者預後較差。

在預後方面，以LAM增加為主的類型，要以KAP增加為主的類型要差。

在腎功能正常的情況下，游離輕鏈的定量對骨髓瘤的診斷、分期及預後判斷均有參考價值。

6. 營養狀況檢測：白蛋白(ALB) 、前白蛋白(PAB) 、轉鐵蛋白(TRF)

患者的營養狀況可極大地影響預後和住院期限。

對患者的營養狀態，可以用ALB濃度來評價，但是由於其含量高，半壽期長(20天)，用於營養狀態監測的靈敏度偏低；但PAB(半衰期為2天)，TRF(半衰期為8天)，在營養不良情況下，二者也都能快速表現出含量的下降。

目前，臨床普遍聯合使用ALB、PAB及TRF三項指標，用於營養狀況的評價和治療效果的監測，保證結果更加靈敏準確。

另外，PAB在肝臟合成，半壽期短，又可作為早期肝功能損傷的指標。

7. 神經系統疾病檢測：IgG、IgA、IgM對血腦屏障完整性的評價以及對椎管內炎性病變的診斷，均需依賴腦脊液(CSF)的檢查。

CSF中IgG水平升高見於多發性硬化症、病毒性腦膜炎和腦炎、細菌性腦膜炎、腦膿腫及大腦硬膜外膿腫等疾病。

8. 血液病檢測：轉鐵蛋白(TRF) 、觸珠蛋白(HPT) 、鐵蛋白(FER) 、抗凝血酶-Ⅲ(AT3)TRF可用於缺鐵性貧血和溶血性貧血的鑑別診斷。

影響鐵代謝或造血的因素都可間接地影響轉鐵蛋白的水平。

HPT可輔助鐵的儲存，其水平下降可見於嚴重血管內溶血。

FER是檢查體內鐵缺乏的最靈敏的指標，缺鐵性貧血、失血以及長期腹瀉造成的鐵吸收障礙可以導致FER降低。

AT3是具有抑制凝血作用的血漿蛋白，是提示血栓形成危險性的重要指標。

二、特定蛋白項目的常規檢測方法

隨著越來越多的特定蛋白被應用於臨床，其檢測方法也發展迅速。

在1959年之前，一直採用經典免疫沉澱方法進行檢測，這存在測定範圍窄、靈敏度低、繁瑣費時及不能自動化等缺點。

1959年，Schultze等報導了透射比濁法（Transmission Turbidimetry）。

這種方法是常用於生化指標的測定，用於特定蛋白檢測，卻存在靈敏度偏低和測定範圍較窄等問題。

近年來，在免疫比濁法的基礎上又出現乳膠增強比濁法。

該方法是利用微小的乳膠顆粒(1μm±)聯接抗體後，在液相中和相應抗原結合後產生光吸收或光散射的變化等來測定抗原含量，這特別增強了免疫比濁法檢測特定蛋白的性能，其靈敏度可以提高1000倍以上，同時其受到非特異性反應的影響也大大減少，因而精確度和重複性皆較好。

1967年，Ritchie等提出了終點散射比濁法（End-point Nephelometry），該方法與免疫沉澱方法、透射比濁法相比，靈敏度高、重複性好、測定範圍寬，但該法測定的仍是抗原抗體反應的第二階段，即出現肉眼可見反應的階段，不適合快速檢測；同時該法易受反應本底干擾，待測抗原的含量越低，本底干擾就越大。

後來出現了終點散射比濁法的一種改進方法，即定時散射比濁法（Fixedtime Nephelometry）。

該方法的基本原理是與終點散射比濁法相似，測定也是抗原抗體反應的第二階段，但在測定散射信號時不與反應開始同步，而是推遲幾秒鐘用以扣除抗原抗體反應的不穩定階段，從而將這種誤差影響降至最低。

其過程是：在抗原抗體反應開始時，留出預反應時間，即散射光信號第一次讀數在反應開始的7.5秒至2分鐘內，大多數情況下2分鐘以後測第二次讀數，並從第二次測信號值扣除第一次讀數信號值，從而獲得待測抗原的信號值並通過儀器處理轉換為待測抗原濃度。

1977年，Sternberg等提出了速率散射比濁法（Rate Nephelometry），該檢測法可測抗原抗體結合反應的第一階段，即尚未出現肉眼可見反應的階段，能夠進行快速檢測，使免疫化學分析發生了質的飛躍。

相比以前的檢測方法，速率散射比濁測定是一種抗原抗體結合的動態測定法，是在抗原抗體結合反應的第一階段，測定其複合物形成的速率（速率法），達到檢測更快速準確的目的。

目前，免疫比濁法已經成為檢測體液中特定蛋白的一種微量、快速、自動化檢測的常規免疫化學分析技術。

根據這一原理來設計的專業分析系統，具有廣泛的測定範圍，從而廣泛的適用於血漿、血清、腦脊液和尿液多種樣本。

同時該系統還可以進行抗原過量監測，可以檢測非特異性反應異常的樣本等。

此外，它還有專門配套設計的試劑，保證了結果的穩定可靠。

這些既符合實驗室免疫檢測和臨床發展的需要，也適合流程管理和質量系統的優化。

對廣大臨床和檢驗工作者來說，在做好特定蛋白檢測的質量控制，保證結果準確性的同時，還應對這些特定蛋白的臨床應用價值，與疾病發生髮展之間的關係，以及可能影響正確檢測的因素，有較全面的了解，才能更好的利用這些指標，為疾病診斷和協助治療提供更好的服務。

三、特定蛋白檢測的質量控制

由於特定蛋白檢測項目逐漸增多，對其技術程序的標準化，診斷試劑的標準化和常規實驗的質量控制已是日益重視。

由於特定蛋白形式多樣、結構複雜、功能不一，以及免疫檢測方法中可能出現的由鉤狀效應造成假陰性等問題，給特定蛋白檢測提出了特別要求。

通過專業的特定蛋白分析系統的使用，強化了質量控制，提高了檢測質量，大幅度的防止漏檢、誤診的發生。

在應用免疫比濁法檢測特定蛋白的質量控制中，要考慮主要因素包括：

1. 免疫反應因素：抗原、抗體、反應介質

2. 特定蛋白分析系統的系統性：儀器、試劑、檢測程序、校準品及質控品

3. 鉤狀效應導致假陰性的識別

據有關質量監督部門調查的結果來看，很多實驗室測定結果的差異較大，其中一個重要的原因是沒有採用一致的參考品進行校準。

第1代參考品(即1967年推出的批號為67／86的WHO免疫球蛋白標準品)能很好地用於免疫擴散和火箭電泳測定的標準化，但由於其有些渾濁，就不太適用於免疫比濁法。

因此，IFCC委託一個研究小組建立了用來製備新一代國際人血清蛋白參考品(RPPHS)的方法，即在嚴格控制的條件下收集血清，在凍干之前用矽吸附去除脂蛋白。

有許多實驗室參加了對白蛋白、a1-酸性糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶、銅藍蛋白、觸珠蛋白、a2-巨球蛋白、轉鐵蛋白、C3、C4、IgG、IgA、IgM和CRP的測定，與較早的參考品值比較，新參考品改變了某些蛋白的濃度，如a1-酸性糖蛋白、a1-抗胰蛋白酶和IgM。

研製RPPHS的目的是用其來校準用於血清蛋白常規測定的第三級參考品，RPPHS可從美國CAP獲得。

當前比較流行的特定蛋白的國際標準是CRM-470，其目標是使一個樣品在全世界得到一個相同的結果。

為此要建立新的國際第二級具血清介質的參考品，用作14種血漿蛋白檢測的參考，以後將有更多蛋白被定值。

1989年國際臨床化學學會(IFCC)會同美國病理學會(CAP)，在與各重要廠商(Abbott、Beckman、Behring等)協商後，指定由Behring公司負責製備國際參考品。

按照IFCC定值方案，統一使用指定的各特定蛋白純化標準為原始標準，避免各實驗室因使用的標準不一致造成定值差異，方案詳細規定了定值的操作程序以及統計方法。

例如，為確保在檢測時各標準，樣品間無基體效應的差異和沒有抗原過剩，要求回歸線通過零點，標準和測定都須做多個稀釋（須以重量法校正），每個稀釋樣品做雙份檢測等。

這使27個定值實驗室（歐洲、美國和日本）步調一致，在規定期限內完成定值。

允許的測定方法為：免疫透射比濁、免疫散射比濁和放射免疫擴散。

在1992年歐洲經濟共同體的共同體參考局(BCR)認可該參考品，並給予代號CRM-470（認可參考品470）。

使用CRM-470標準後，各重要廠商(Abbott、Beckman、Behring等)都已簽署認可CRM-470作為他們公司的第一標準，這帶來了一系列的良好效果，如實驗室結果的可比性得以改善；依賴方法偏差很低；任何時候任何人可以用；血清蛋白的化學物理特性很好；成年人的參考範圍的一致性；液體和尿液的分析也可以得到改善。

近年來，其它非簽署公司要對自己的校準品定值時，已經形成採用上述公司的特定蛋白檢測系列，按照數值傳遞實驗方案，對本公司校準品定值。

然後再以患者樣品和認可的上述公司檢測系列作方法學比較，確認傳遞的可靠性，再將產品系列推向市場。

值得注意的是，由於免疫方法檢測的特殊性，抗原過量的監測是檢測結果的質量控制的另一個重要保證。

為了保證檢測結果的準確性，檢測系統應在檢測中保證抗體恆定過量，即反應結束後，反應介質中有游離抗體存在，而無游離抗原存在。

保證抗體恆定過量，最好的方法是在反應過程完成時，再加入已知相應抗原到該反應介質中，如新加入抗原可與游離抗體結合反應，則產生新的速率峰值，由此證明之前檢測到的速率峰信號是由待測抗原完全反應產生的；若新加入抗原後不出現新的速率峰，則說明反應介質中無游離抗體存在，即可能出現待測抗原尚未完全反應，那麼之前的速率峰信號可能不是在抗體恆定過量的條件產生，可能受到鉤狀效應的影響，結果不可靠，需將待測樣品進一步稀釋後重測。

該設計是真正的抗原過量監測，能完全保證檢測結果的真實準確可靠，以美國Beckman公司特定蛋白分析的專利設計為例，示意圖如下：

特定蛋白可為臨床提供有效的病理生理指標，作為臨床診斷、判斷治療效果以及分析預後的依據。

選擇最優的方法學和專業的檢測系統，是保證檢測結果準確的首要前提。

目前隨著國內外對特定蛋白檢測標準化的重視，特別是更加有效的參考品的出現，有力地促進了特定蛋白檢測的質量水平的提高。