三陰性乳腺癌的腫瘤特異性CD8陽性T細胞免疫治療

作者：中華乳腺病雜誌來源：腫瘤資訊

三陰性乳腺癌（TNBC）是雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人表皮生長因子受體2（HER2）表達均為陰性的一類乳腺癌，臨床上常規的治療手段包括手術、放射治療及化療。

腫瘤的免疫治療是目前的研究熱點之一，其中起重要作用的是腫瘤特異性分化群8（CD8）陽性T細胞。

在基礎研究方面，CD8陽性T細胞在TNBC的過繼性免疫治療和腫瘤疫苗領域均有所應用。

在臨床研究方面，腫瘤浸潤CD8陽性T細胞與TNBC患者的預後相關，並且，目前已開展的程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）/程序性細胞死亡蛋白1配體（PD-L1）抑制劑亦與腫瘤特異性CD8陽性T細胞的活化調控機制有關。

因此，筆者就腫瘤特異性CD8陽性T細胞在三陰性乳腺癌免疫治療中的應用進行簡要的綜述。

根據ER、PR及HER2的表達情況，可將乳腺癌分為5種亞型，分別是管腔A型、管腔B型、管腔B型HER2陽性、HER2過表達型和三陰型（TNBC）【1】。

其中，TNBC患者占乳腺癌全部患者比例的10%～17%，其臨床特點是癌細胞ER、PR和HER2表達均為陰性，患者發病年齡偏低，疾病進展快且較早出現內臟轉移【2】。

目前，對於可手術切除的TNBC，手術聯合放化療是常規治療手段，而對於轉移性TNBC尚無有效的治療手段，多學科綜合治療可能是延長患者生存期的方法之一【3】。

根據最新的轉錄組學研究分類可將TNBC分為6種亞型，分別是基底1型、基底2型、免疫調節型、間質型、間質幹細胞型和管腔雄激素受體型【4】。

在上述各亞型中，免疫調節型的患者具有相對好的預後，可能與體內癌細胞的免疫應答基因被激活有關【5】。

目前，針對TNBC的免疫治療是學者們關注的熱點之一，腫瘤特異性T細胞又是研究的重中之重，且部分臨床試驗已取得了令人矚目的效果。

依據不同的功能分類，腫瘤特異性T細胞又可進一步分為CD8細胞毒性T細胞、CD4輔助T細胞和CD4調節T細胞【5-6】。

筆者將近年來腫瘤特異性CD8陽性T細胞在TNBC研究中的應用作一簡要的綜述。

一、腫瘤特異性CD8陽性T細胞的免疫效應概述

在TNBC細胞的生物學行為中，免疫系統扮演了雙重角色——促進腫瘤生長和清除腫瘤。

這看似矛盾的兩方面實際上包含了不同細胞之間的相互作用，這些細胞包括腫瘤細胞、免疫細胞和腫瘤間質細胞等【7】。

在體內環境下，腫瘤細胞與免疫細胞之間的關係通常經歷3個時期：清除期、平衡期和逃逸期。

在清除期，先天性免疫首先發揮作用，由巨噬細胞和自然殺傷細胞引起急性炎症反應，隨後獲得性免疫進一步起效，包括樹突狀細胞捕獲腫瘤抗原並將其遞呈給初始CD8陽性T細胞，後者再轉化為腫瘤特異性CD8陽性T細胞並進入腫瘤微環境中靶向殺傷腫瘤細胞，此階段腫瘤細胞主要被免疫細胞所「清除」。

在平衡期，未被清除的腫瘤細胞發生突變，例如不表達主要組織相容性複合體（MHC）Ⅰ類分子、共刺激信號分子和隱藏腫瘤抗原，從而不被之前活化的CD8陽性T細胞識別，並且，腫瘤細胞還可招募調節T細胞以抑制腫瘤特異性CD8陽性T細胞的靶向殺傷作用，經歷上述過程後炎症反應從急性期進入慢性期，腫瘤細胞與免疫細胞亦處於相對「平衡」的階段。

在逃逸期，腫瘤細胞通過自身突變以及間質細胞的幫助，從腫瘤特異性CD8陽性T細胞的作用範圍內「逃逸」，從而導致腫瘤的局部擴散和遠處轉移【5】。

正因為腫瘤細胞具有非常強的免疫逃逸能力，體內環境下由初始CD8陽性T細胞轉化而來的腫瘤特異性CD8陽性T細胞並不能完全殺滅腫瘤細胞。

因此，學者們希望通過各種方式獲得靶向殺傷能力更強的CD8陽性T細胞。

二、CD8陽性T細胞與TNBC過繼性免疫治療研究

過繼性免疫治療的原理是採集人體的免疫細胞，經體外改造和擴增後再輸注回人體發揮抗腫瘤作用【6】。

過繼性免疫治療的效應細胞包括CD8陽性T細胞、自然殺傷細胞和巨噬細胞等，目前常用的效應細胞是CD8陽性T細胞【8】。

體外獲得腫瘤特異性CD8陽性T細胞的方法主要有2類：一類是與腫瘤抗原接觸後篩選出具有靶向識別能力的CD8陽性T細胞；另一類是採用各種方法直接改變CD8陽性T細胞受體（TCR）的表達序列，使其靶向識別腫瘤抗原，即嵌合抗原受體（CAR）T細胞【8】。

依據第一類方法，Harao等【8】使用一種針對4-1BB/CD137蛋白的抗體烏瑞魯單抗，可刺激TNBC瘤體內4-1BB/CD137高表達的CD8陽性T細胞活化，從而靶向殺傷已發生基因突變的TNBC細胞，而對正常組織細胞無殺傷作用。

Chandra等【9】發現冷凍消融加上薑黃素可激活識別腫瘤抗原的CD8陽性T細胞，這些CD8陽性T細胞可顯著抑制BALB/c小鼠體內4T1細胞（一種來源於BALB/c小鼠自發性乳腺腫瘤的TNBC細胞系）的生長。

另外，與腫瘤抗原接觸後篩選腫瘤特異性CD8陽性T細胞的方法在黑色素瘤的臨床治療方面已取得了成果，而在實體瘤（包括TNBC）的研究尚未廣泛開展，其中一個主要原因是篩選出的CD8陽性T細胞進入體循環後，並不能直接靶向定居於實體瘤內，從而大大降低CD8陽性T細胞的抗腫瘤效應。

因此，學者們正在開展相關研究試圖克服這一問題，其中一個突破口是將黑色素瘤治療成功經驗應用到TNBC【10】。

例如，攜帶有針對黑色素瘤MAGE-C2（MC2）表位的TCR序列CD8陽性T細胞能有效殺傷黑色素瘤細胞，Kunert等【10】將這一效應延用至TNBC免疫治療研究：他們先用氮胞苷和丙戊酸預處理TNBC細胞，使其MC2表位表達上調，再將CD8陽性T細胞作用於TNBC細胞，結果發現其中一種CD8陽性T細胞的TCR序列能特異性靶向識別TNBC細胞的MC2表位，從而能有效殺傷癌細胞但不損傷正常的組織細胞。

如前所述，除了篩選靶向識別腫瘤抗原的CD8陽性T細胞，過繼性免疫治療的另一應用是針對不同腫瘤抗原建立CAR-T細胞，從而達到靶向殺傷癌細胞的目的。

例如，葉酸α受體（FRα）和間皮素均可作為TNBC的理想標誌物，Song等【11】針對FRα構建出CAR-T細胞，可在體外環境下特異性殺傷FRα陽性TNBC細胞，同時亦能顯著抑制小鼠體內FRα陽性TNBCMDA-MB-231細胞的成瘤速度。

Tchou等【12】設計出針對間皮素的CAR-T細胞，經檢測發現，體外條件下CAR-T細胞靶向殺傷TNBC細胞的有效率為31.7%，而初始CD8陽性T細胞的有效率僅為8.7%。

當然，並非所有的腫瘤抗原均可用於設計CAR-T細胞，而需滿足如下3個條件：1、該抗原屬於細胞膜蛋白；2、該抗原在腫瘤細胞中高度表達；3、該抗原在正常組織細胞不表達或表達極低。

通常前兩個條件容易滿足，但不一定符合第3個條件，如此設計出的CAR-T細胞將有可能殺傷表達該抗原的正常組織細胞，從而造成不同程度的不良反應【13】。

三、腫瘤疫苗對CD8陽性T細胞的調控作用

腫瘤疫苗的作用機制是利用疫苗刺激抗原遞呈細胞（APC），後者會將腫瘤抗原遞呈給效應細胞（CD8陽性T細胞、T輔助細胞等），其中CD8陽性T細胞可直接發揮抗腫瘤效應。

Zhang等【14】從患者的外周血單核細胞中提取APC，再將APC與MDA-MB-231細胞進行電熔以製備疫苗，該融合疫苗在體外條件下可誘導腫瘤特異性CD8陽性T細胞，靶向殺傷MDA-MB-231細胞。

與此類似，Paret等【15】根據53%的TNBC患者癌細胞表達CXorf61蛋白這一特點，構建CXorf61的RNA編碼逆轉錄病毒並轉染樹突狀細胞，再將其與人CD8陽性T細胞共培養可獲得特異性識別CXorf61的66-74表位CD8陽性T細胞；並且，他們繼續用CXorf61的RNA編碼逆轉錄病毒接種於人白細胞抗原（HLA）-A*02轉基因小鼠，在小鼠體內亦獲得CXorf61特異性T細胞，並進一步克隆出針對CXorf61蛋白的HLA-A*0201限制性識別表位（66-74和79-87）。

事實上，除了上述研究以外，還可通過向實驗動物接種疫苗從而在體內條件下獲得腫瘤特異性CD8陽性T細胞。

例如，腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體受體2（TRAIL-R2）在實體瘤細胞廣泛表達，通過攜帶TRAIL-R2的DNA質粒構建疫苗並輸注入BALB/c小鼠體內，可獲得TRAIL-R2特異性T細胞，進而靶向殺傷TRAIL-R2高表達的TNBC細胞【16】。

在C57BL/6小鼠負瘤模型中，採用共刺激因子CD137激動劑和免疫檢查點抗體聯合放射治療可誘導腫瘤特異性CD8陽性T細胞的活化，這些CD8陽性T細胞的共同特點是在佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（PMA）和離子黴素的刺激下，可表達Tim-3、顆粒酶B和Ki67，並分泌γ干擾素以增強抗腫瘤效應【17】。

四、腫瘤浸潤CD8陽性T細胞與TNBC患者的預後

腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）是指浸潤於腫瘤組織中的淋巴細胞。

已有研究證實，TIL與TNBC患者的預後具有相關性【18】。

目前臨床研究的趨勢是將TIL進一步分為不同亞組，以觀察這些亞組的細胞數量或比例與患者預後的關係。

這些亞組包括CD8陽性T細胞、CD4輔助T細胞和CD4調節T細胞等，且超過60%的TNBC淋巴細胞浸潤是以CD8陽性T細胞為主【19】。

一篇薈萃分析發現TIL與TNBC患者的無病生存和總生存具有正相關性，而進一步分析可知，CD8陽性T細胞的數量與患者無病生存也具有正相關性【20】。

對於不同分期的TNBC患者，腫瘤浸潤CD8陽性T細胞具有相似的預後作用（表1）【21-26】。

Miyashita等【21】觀察了131例接受新輔助化療的TNBC患者，發現腫瘤浸潤CD8陽性T細胞數量較高預示著患者有更長的無復發生存期和乳腺癌特異性生存期，並且CD8陽性T細胞/調節T細胞數比例亦能預示患者的無復發生存期。

Asano等【22】觀察了該院2007—2013年177例早期可切除的乳腺癌患者標本，結果發現TNBC患者的腫瘤浸潤CD8陽性T細胞/調節T細胞比例較其他類型的乳腺癌患者高，且這類患者在接受新輔助化療後更易獲得病理上的完全緩解。

同樣，Mella等【23】觀察了197例患者的腫瘤標本，發現腫瘤浸潤CD8陽性T細胞數量升高預示著TNBC患者有更長的疾病特異性生存期；而對於淋巴結陰性的TNBC患者，CD8陽性T細胞數量與患者的總生存和無病生存具有正相關性【24】。

根據CD8陽性T細胞在腫瘤組織中的浸潤範圍，將腫瘤浸潤CD8陽性T細胞進一步分為2類，包括腫瘤浸潤CD8陽性T細胞和腫瘤間質浸潤CD8陽性T細胞，而前者可以更加準確地預測患者的預後。

Liu等【25】比較了瘤體內和腫瘤間質內CD8陽性T細胞的浸潤情況，發現前者與患者較好的疾病特異性生存期相關，而後者則無明顯相關性。

另一項研究亦證實，瘤體內CD8陽性T細胞浸潤預示著TNBC患者疾病特異性病死率下降28%，而腫瘤間質內CD8陽性T細胞浸潤預示患者的疾病特異性病死率僅下降21%【26】。

五、CD8陽性T細胞與免疫檢查點抑制劑的臨床試驗研究

程序性細胞死亡蛋白1（PD-1）及程序性細胞死亡蛋白1配體（PD-L1），存在於APC和CD8陽性T細胞表面，兩者結合後可抑制CD8陽性T細胞的增殖，從而抑制CD8陽性T細胞介導的免疫應答。

目前，PD-1/PD-L1抑制劑是腫瘤免疫治療的研究熱點之一。

有研究證實，TNBC細胞同樣表達PD-L1，且其表達水平與腫瘤浸潤CD8陽性T細胞的數量具有一致性，因此，針對這類TNBC患者PD-L1抑制劑的治療效果更好【27】。

另一項研究表明，採用PD-1抑制劑潘布羅利珠單抗（pembrolizumab）治療轉移性TNBC可使該類患者的6個月無進展生存率達23.3%，而接受PD-L1抑制劑阿特珠單抗（MPDL3280A）治療的TNBC患者，其6個月無進展生存率可達27%【28】。

未來將會有更多的免疫檢查點抑制劑用於臨床試驗，包括作用於PD-1/PD-L1和T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）受體等，其臨床治療效果也值得期待【28-29】。

六、結語

免疫治療是目前TNBC治療的研究熱點，而腫瘤特異性CD8陽性T細胞在腫瘤疫苗、CAR-T細胞製備和免疫檢查點抑制劑的應用方面均發揮著重要作用。

當然，CD8陽性T細胞靶向治療並非完美，仍然有很多問題亟待解決，例如，針對腫瘤抗原的CD8陽性T細胞也可能攻擊攜帶有該抗原的正常組織細胞，從而造成不同程度的不良反應。

如何篩選更具有特異性的腫瘤抗原是學者們面臨的一個問題。

其次，部分腫瘤抗原並非持續表達，而是會隨著腫瘤細胞的突變而變化，一旦這些抗原發生變化，原先可以靶向識別該抗原的CD8陽性T細胞可能不再識別腫瘤細胞，從而造成癌細胞的逃逸。

最後，瘤體內腫瘤浸潤CD8陽性T細胞的存在預示患者有較好的預後，這些CD8陽性T細胞的抗腫瘤作用機制亦需要進一步研究。

雖然目前還面臨著許多的未知因素，但是在不久的將來，基於腫瘤特異性CD8陽性T細胞的免疫研究可能為TNBC患者的臨床治療提供新的途徑和選擇。

參考文獻

• Llombart-Cussac A, Cortés J, ParéL, et al. HER2-enriched subtype as a predictor of pathological complete response following trastuzumab and lapatinib without chemotherapy in early-stage HER2-positive breast cancer (PAMELA): an open-label, single-group, multicentre. phase 2trial. Lancet Oncol. 2017;18(4):545-554.

• Shu S, Lin CY, He HH, et al. Response and resistance to BET bromodomain inhibitors in triple-negative breast cancer. Nature. 2016;529(7586):413-417.

• Rugo HS, Olopade OI, De Michele A, et al. Adaptive randomization of veliparib-carboplatin treatment in breast cancer. N Engl J Med. 2016;375(1):23-34.

• Mayer IA, Abramson VG, Lehmann BD, et al. New strategies for triple-negative breast cancer--deciphering the heterogeneity. Clin Cancer Res. 2014;20(4):782-790.

• Cimino-Mathews A, Foote JB, Emens LA.Immune targeting in breast cancer. Oncology. 2015;29(5):375-385.

• Yeong J, Thike AA, Lim JC, et al. Higher densities of Foxp3+regulatory T cells are associated with better prognosis in triple-negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2017;163(1):21-35.

• Cecil DL, Slota M, O'Meara MM, et al. Immunization against HIF-1αinhibits the growth of basal mammary tumors and targets mammary stem cells in vivo. Clin Cancer Res. 2017;23(13):3396-3404.

• Harao M, Forget MA, Roszik J, et al. 4-1BB-enhanced expansion of CD8+TIL from triple-negative breast cancer unveils mutation-specific CD8+T cells. Cancer Immunol Res. 2017;5(6):439-445.

• Chandra D, Jahangir A, Cornelis F, et al. Cryoablation and Meriva have strong therapeutic effect on triple-negative breast cancer. Oncoimmunology. 2015;5(1):e1049802.

• Kunert A, van Brakel M. MAGE-C2-specific TCRs combined with epigenetic grug-enhanced antigenicity yield robust and tumor-selective T cell responses. J Immunol. 2016;197(6):2541-2552.

• Song DG, Ye Q, Poussin M, et al. Effective adoptive immunotherapy of triple-negative breast cancer by folate receptor-alpha redirected CAR T cells is influenced by surface antigen expression level. J Hematol Oncol. 2016;9(1):56.

• Tchou J, Wang LC, Selven B, et al. Mesothelin, a novel immunotherapy target for triple negative breast cancer. Breast Cancer Res Treat. 2012;133(2):799-804.

• Balakrishnan A, Goodpaster T, Randolph-Habecker J, et al. Analysis of ROR1 protein expression in human cancer and normal tissues. Clin Cancer Res. 2017;23(12):3061-3071.

• Zhang P, Yi S, Li X, et al. Preparation of triple-negative breast cancer vaccine through electrofusion with day-3 dendritic cells. PLo S One. 2014;9(7):e102197.

• Paret C, Simon P, Vormbrock K, et al. CXorf61 is a target for T cell based immunotherapy of triple-negative breast cancer. Oncotarget. 2015;6(28):25356-25367.

• Piechocki MP, Wu GS, Jones RF, et al. Induction of proapoptotic antibodies to triple-negative breast cancer by vaccination with TRAIL death receptor DR5 DNA. Int J Cancer. 2012;131(11):2562-2572.

• Verbrugge I, Hagekyriakou J, Sharp ll. et al. Radiotherapy increases the permissiveness of established mammary tumors to rejection by immunomodulatory antibodies. Cancer Res. 2012;72(13):3163-3174.

• Gujam FJ, Edwards J, Mohammed ZM, et al. The relationship between the tumour stroma percentage. clinicopathological characteristics and outcome in patients with operable ductal breast cancer. Br J Cancer. 2014;111(1):157-165.

• Stanton SE, Disis ML.Clinical significance of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer. J Immunother Cancer. 2016;4:59.

• Mao Y, Qu Q, Chen X, et al. The prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes in breast cancer:a systematic review and meta-analysis. PLo S One. 2016;11(4):e0152500.

• Miyashita M, Sasano H, Tamaki K, et al. Prognostic significance of tumor-infiltrating CD8+and FOXP3+lymphocytes in residual tumors and alterations in these parameters after neoadjuvant chemotherapy in triple-negative breast cancer:a retrospective multicenter study. Breast Cancer Res. 2015;17:124.

• Asano Y, Kashiwagi S, Goto W, et al. Tumour-infiltrating CD8 to FOXP3 lymphocyte ratio in predicting treatment responses to neoadjuvant chemotherapy of aggressive breast cancer. Br J Surg. 2016;103(7):845-854.

• Mella M, Kauppila JH, Karihtala P, et al. Tumor infiltrating CD8+T lymphocyte count is independent of tumor TLR9 status in treatment naive triple negative breast cancer and renal cell carcinoma. Oncoimmunology. 2015;4(6):e1002726.

• Chen Z, Chen X, Zhou E, et al. Intratumoral CD8 (+) cytotoxic lymphocyte is a favorable prognostic marker in node-negative breast cancer. PLo S One. 2014;9(4):e95475.

• Liu S, Lachapelle J, Leung S, et al. CD8+lymphocyte infiltration is an independent favorable prognostic indicator in basal-like breast cancer. Breast Cancer Res. 2012;14(2):R48.

• Ali HR, Provenzano E, Dawson SJ, et al. Association between CD8+Tcell infiltration and breast cancer survival in 12;439 patients. Ann Oncol. 2014;25(8):1536-1543.

• Mittendorf EA, Philips AV, Meric-Bernstam F, et al. PD-L1expression in triple-negative breast cancer. Cancer Immunol Res. 2014;2(4):361-370.

• Matsumoto H, Koo SL, Dent R, et al. Role of inflammatory infiltrates in triple negative breast cancer. J Clin Pathol. 2015;68(7):506-510.

• 張歡, 吳斌. 乳腺癌免疫治療的研究進展. 中華乳腺病雜誌. 2015;9(4):264-269.

責任編輯：腫瘤資訊-Ruby