智因東方速遞｜兒科基因組學：在兒童罕見病診斷中的應用

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導 讀

每年的2月28日為世界罕見病日，罕見病又稱「孤兒病」，是指那些發病率極低的疾病。

雖然在中國並沒有明確的定義，但仍有超數十萬的罕見病病人。

2018新春伊始，智因東方為奮戰在兒科遺傳病診斷戰線上的臨床醫生、遺傳學家奉上一篇《NATURE REVIEWS GENETICS》新近刊登的綜述《Paediatric genomics: diagnosing rare disease in children》（PMID: 29398702）的完整譯文，這篇綜述將NGS用於兒童遺傳病診斷的方方面面進行了闡述，包括以下大家關心的問題：

哪些患者需要做基因檢測？

選擇哪種檢測策略，

是Sanger測序、WES、trioWES還是WGS？

核心家系模式（trio）

與先證者模式相比有什麼優勢？

變異數據該如何過濾、判斷，

並與臨床信息整合分析？

如何考量基因檢測所涉及的倫理問題？

對上述及其他諸多問題，文章進行了全面的、高屋建瓴的闡述。

本文堪稱鴻篇巨製，是全面深刻理解遺傳病精準診斷的不可多得的綱領性文獻。

譯文將以四個部分發布在轉化醫學網上。

兒科基因組學：在兒童罕見病診斷中的應用

Caroline F. Wright, David R. FitzPatrick and Helen V. Firth

摘要|很多罕見病都累及兒童，且這些罕見病患兒的發病情形多數是由於潛在的遺傳因素所導致的。

然而，利用當前的知識和技術對這些罕見病進行分子診斷仍是一項挑戰。

兒科基因組學通過將新一代測序技術，特別是全外顯子組測序(WES)和全基因組測序(WGS)技術，應用到該領域的研究及臨床實踐中以攻克這項挑戰，目前其尚處於一個發展不甚成熟但進展非常迅速的階段。

這種複雜多學科的方法，結合不斷增加的人群遺傳變異數據，已經大幅提高了致病基因的發現率，並促進了兒科罕見疾病的診斷。

重要的是，對於受累家庭，一種更好地了解罕見病遺傳基礎的方法，能夠轉化成更精準的疾病預後、管理、監測和遺傳諮詢，並促進新療法的研究，和提供更好的醫療支持。

罕見病被定義為，在普通人群中發生率低於1/2,000 的疾病。

由於罕見病通常會對生殖適合度產生不利影響，故而這類疾病在一般人群中很少見。

目前約有7,000種罕見病，其中～80％被認為是由於遺傳因素所導致。

多數（50-75％）罕見病累及兒童, 且很多是具有一系列表型、累及多系統的嚴重疾病。

從整體來看，這些疾病是兒科住院患兒的重要病因，35%的這些罕見病患兒在1歲內死亡；1/3的先天罕見病患兒的生存期將不超過5年。

雖然近1500個基因的罕見變異已被證明可導致發育障礙性疾病（developmental disorders），但仍有許多致病基因有待被發現。

精準診斷——這裡被定義為識別出可解釋罕見病臨床特徵（表型）的精確分子致病原因（基因型）——是安全醫療實踐的基礎。

對於罕見遺傳病的患兒們來說，一種可靠的基因診斷方法，不僅為其得以利用醫學文獻中的豐富信息提供了鑰匙，這些文獻信息提供了疾病管理和治療方面的建議，還有可能使其接觸到特定疾病的支持群體，使這些罕見病家庭不再孤立無援。

強有力的基因診斷也能夠精確測定家庭成員目前和未來的患病風險。

然而，因這些疾病的基因和表型的多變性以及因我們認識的局限性所致，對每個個體進行精確診斷仍然是一個相當大的挑戰。

為應對這一挑戰，國際罕見病研究聯盟（International RareDiseases Research Consortium, IRDiRC）最近發出了2017-2027未來十年的願景：「讓所有罕見病患者在就醫的第一年，都能夠得到精準的診斷、關懷，以及儘可能的治療資源」。

致病性基因變異的範圍，從變異大小來說，可以從單個鹼基對的替換、缺失或重複，到基因結構變異，乃至整個染色體拷貝數的改變（非整倍體），或基因組拷貝數的改變（例如二/三倍體嵌合）。

不僅由這些變異單獨導致疾病的情況非常罕見或極罕見（＜100,000），而且通常還存在由於疾病外顯率差異以及同種疾病不同患者的表現度差異所呈現的臨床表型的多變性。

這種遺傳病的多變性部分甚至全部（在極端條件下）可歸因於基因座異質性（locus heterogeneity）和等位（基因）異質性（allelic heterogeneity）；例如「智力障礙」的臨床特徵，可能是由一個或多個（＞700個）不同基因的單個等位基因變異或雙等位基因變異引起的。

其他導致遺傳病多變性的原因還包括一個基因或多個其他基因（修飾）的多個遺傳變異和環境因素，但目前我們對這些因素很難進行識別和量化。

因此，大多數罕見遺傳病並不具有高度特異性的臨床表型，並且臨床上通過經典方法難以診斷，所謂的經典方法，即依賴於臨床表型模式一致性的識別，如發育異常、特異部位的畸形以及特徵性面容等表型的組合。

此外，並不是所有兒科罕見病病因都歸因於遺傳，在世界範圍內仍有很小一部分但非常重要的原因是由於致畸物的接觸（如胎兒酒精綜合徵，先天性弓形蟲病或茲卡病毒感染）。

因此到目前為止，大多數罕見病患兒，尤其是發育障礙的患兒，仍未得到確診。

新一代測序技術（NGS）大大提升了獲得基因診斷的預期，因為在用這種方法時，這些患兒的基因型和臨床表型是不可知的。

對基因組中每個基因同時測序，能檢測出個體基因組中存在的絕大多數可能致病的基因變異，使得跨越一系列複雜的兒科臨床表型進行診斷成為可能，甚至對於罕見和極其罕見的病例，包括那些兒科臨床醫生可能都很陌生的罕見病，也可望得到診斷。

一旦某綜合徵的遺傳基礎得到確認，其被發現的臨床表現往往會增多（稱為綜合徵擴張），因為我們已經認識到，相同的分子遺傳基礎可以表現為輕微表型或部分表型的組合。

基因組檢測技術的進步對兒科罕見病有著特殊的影響，與成人罕見遺傳病相比，兒科罕見病因其早期發病以及致病變異性質和發生頻率的差異，意味著診斷陽性率通常會較高。

嚴重發育障礙性疾病的生殖適合度通常很差；沒有強大的平衡選擇（相對罕見），或受到社會上和/或地理上隔絕的婚配的影響（相對常見），這類疾病的基因變異在人群中難以傳代維持。

因此，嚴重兒科遺傳病的致病變異預期應該是極罕見變異和往往是新發（de novo）變異（顯性遺傳模式），或在近親婚配人群或奠基者人群中富集的變異（隱性遺傳模式）。

儘管人類基因組在不同的個體之間存在大約400萬至500萬個的多態性變異位點，但這些變異位點絕大多數是常見且良性的變異。

那些罕見危害性新發變異（和雙等位變異的組合）不太可能出現在成人對照群體中，故兒科罕見病的基因診斷可以由此而簡化。

Figure1 | 各類兒科疾病利用全外顯子組測序（WES）的診斷率（基於文獻報導）

上圖中給出了每個表型類別的全外顯子組測序的診斷率和相應的PubMed文獻識別號（PMID）；僅採用了病例數≥10的臨床病例系列，且僅包括已知或可能致病基因的致病性或可能的致病性變異。

除了神經發育障礙性疾病以外，其他許多種類的疾病缺少相應的研究報導。

上圖中圖框的大小與在兒科臨床實踐中統計的疾病表型流行率大致成正比。

本文主要綜述了基因組學在兒科罕見病診斷中的應用，不涉及腫瘤的體細胞變異或基因組學在兒科癌症診斷或管理中的應用。

本文將分成以下四個部分進行論述：

1.從傳統的基因診斷檢測轉向NGS檢測的益處。

2.數據分析中的問題。

3.全外顯子測序（WES）或全基因組測序（WGS）在目前臨床上應用的主要適應症。

4.兒科基因組學的未來。

從基因檢測到基因組檢測

1

傳統的基因檢測

在過去，臨床遺傳學主要依賴兩種類型的基因檢測：高度集中於分子區域的高解析度的單基因檢測和全基因組低解析度的細胞遺傳學檢測 (FIG. 2a)。

在單基因分子檢測中，根據患者的臨床表現選擇特定基因進行Sanger測序或基因分型。

通過這種檢測得到確診的機率，取決於醫師正確識別病症的潛在遺傳病因，並選擇正確的檢測方案。

因此，單基因分子檢測最適合用於診斷由一個或少數幾個基因突變導致的高度特異的臨床表型。

例如，大多數「經典」遺傳病是用這種方法進行診斷的，如囊性纖維化（由CFTR變異引起） 或Duchenne型肌營養不良症（由DMD變異引起）, 而低解析度全基因組檢測方法，例如G顯帶顯微鏡核型分析（解析度約為5-7Mb），可以用於診斷常見的三倍體異常和染色體部分結構非整倍體異常，還包括一些明顯散發的發育障礙性疾病，後者往往由於染色體部分結構發生了罕見的重複或獨特的大片段的不平衡所導致。

較小一些的結構性變異，例如拷貝數變異（CNVs），可以通過基因組微陣列的方法來進行分子核型檢測，這種方法的解析度通常可達50-100kb。

基因組微陣列可檢測到基因組中任何位置的致病性CNVs，包括與微缺失和/或微重複綜合徵相關的重複發生的變異。

然而與NGS相比，這些檢測技術診斷敏感性較低，僅能診斷出約10％的兒科罕見病患兒。

2

現代基因檢測技術

NGS技術能夠對多個基因, 進行大規模的平行測序，這使得臨床遺傳學 發生了革命性的變化。

臨床醫生現在可以要求同時對多個基因、甚至全外顯子組或全基因組進行測序，而非僅僅選擇對單個基因或單一類型的變異進行檢測。

這種高解析度的全基因組檢測方法結合了單分子檢測和全基因組細胞遺傳學檢測的優點(FIG.2a)。

許多兒科疾病是由眾多不同基因中的一種基因變異引起的，因此，對多個基因同時測序可以進行快速且全面的分子遺傳學分析。

舉例來說，Bardet- Biedl綜合徵可能是由20多個基因的變異引起的，其臨床表型難以區分; 同樣，先天性感音神經性聽力障礙的致病變異也有很多，其在臨床上難以區分，但在分子遺傳學上卻存在顯著差異。

針對這些情況，對所有已知的致病基因同時進行檢測將能改善並加速診斷進程。

NGS對於可能由基因組的上千個基因的任何一個的單核苷酸變異（SNV），或小的插入和/或缺失（indels）導致的罕見發育障礙性疾病的診斷特別有用。

依次地檢測每個候選基因已不再是可行的方法 (FIG. 2b)。

（譯者註：這裡對Sanger測序和NGS的比較性論述非常關鍵，Sanger測序的敏感性存在局限，Sanger測序驗證時常會對NGS檢出的雜合變異和嵌合體變異給出假陰性的結果）

以NGS應用於嬰兒型癲癇性腦病的基因診斷為例，嬰兒型癲癇性腦病是可由數十種基因中的任何一種基因變異導致的一類異質性疾病，在NGS的驅動下，該疾病在2012年至2015年間已發現和鑑定出31個新的致病基因。

NGS技術檢測SNVs和indels的敏感性非常高，雖然Sanger測序仍被許多實驗室認為是金標準，但實際證明NGS技術可能更優越，尤其是在檢測雜合性變異和嵌合體變異方面，雜合性變異是指目標變異僅出現在染色體對中的一個拷貝上，嵌合體變異是指僅在個體中部分細胞亞群中出現的變異。

NGS數據也可以用來檢測CNVs和其他的結構性變異，儘管在這方面NGS分析的有效性目前還落後於微陣列。

然而，經過優化的基因panel採用NGS深度測序對於檢測小的外顯子缺失(＜10kb) 已證明非常有用，而這部分變異往往容易被低解析度微陣列檢測所遺漏，同時WES和WGS兩種方法均已成功用於檢測大的CNVs(＞500 kb)。

對發育障礙性疾病的患兒進行WES或WGS 檢測之前，是否進行基因組微陣列檢測的問題目前尚未解決，因為各個檢測的敏感性和特異性取決於所選擇檢測方法的特性、分析流程的部署以及對不同大小CNVs的診斷率。

雖然NGS技術能對基因組上每一個基因和每一個順式調控元件（CRE）進行測序，但兒科臨床報導通常關注那些已知與兒童期發病的罕見病相關的基因的變異。

然而，基因組中約70％的基因和幾乎所有的CREs在人類健康和發育中的功能仍然未知，因此可能導致疾病的許多變異通常不會被報導，因為這些變異在分析時出現在未知疾病相關性的基因上。

此外，短讀長的NGS無法可靠地檢測出三鹼基重複擴增，而這涉及到兒科疾病如脆性X綜合徵、先天性肌強直性營養不良和Friedreich共濟失調等疾病的診斷。

另外，NGS對小片段CNVs的檢測通常表現也較差，如外顯子缺失或重複的檢測，這是某些疾病如杜氏肌營養不良 和脊髓性肌萎縮症（SMA）1型的主要致病原因。

合子後的嵌合體變異在低覆蓋率的檢測數據中經常會被遺漏，這類病例中受累患兒經常是de novo變異引起的，也有可能遺傳自未發病的嵌合體的父親或母親。

因此，至關重要的是要回顧審核每份報告可能缺失的數據，並確定檢測和/或分析是否覆蓋了所有相關基因，和是否檢測了通常與該疾病相關的所有變異類型。

（譯者註：這裡提到了NGS在檢測小型變異和大型CNV方面的優勢，及其局限性。

值得注意的是，NGS 對於中等片段CNV，例如連續幾個外顯子缺失/重複的檢測，已有些實驗室和研究組做了探索並取得了積極進展）

3

基於新一代測序技術的診斷檢測

NGS用於臨床診斷的策略有很多種，根據測序靶標區域數量和類型的不同而不同。

靶標檢測方法，包括對完整的單個基因進行測序，例如之前已經對單獨變異進行過基因分型的疾病；對疾病特異性基因進行測序，檢測範圍從2至＞2,000個基因中組成的不同大小的基因檢測panel；對目前與單基因疾病有關的約4,000個基因的所有外顯子進行測序，這也被稱為臨床外顯子組或孟德爾組（Mendeliome）。

相比之下，通過WGS對WES 和整個基因組的所有約20,000個蛋白質編碼基因進行的測序本質上應屬於非靶標檢測。

所有基於NGS的診斷方法都會生成大量數據，但不同檢測之間的數據量的差異可能很大，從一個小基因的幾百個鹼基對，其中僅含有少數變異的數據量到整個基因組30億個鹼基對每個人約有4-5百萬個變異的數據量 (FIG. 2c)。

隨著平行檢測的基因數的增加和產生數據量的增多，檢測的敏感性也隨之增加，而檢測的特異性將會降低，並且來自後續法律和倫理的挑戰將會增加(BOX 1)。

尤其是關於如何處理未經許可的二次分析的問題，由於每個基因組中數量龐大的變異信息和其應用範圍的廣泛性，這個問題是非常有爭議性的。

WES或WGS為各種疾病的基因組篩查提供了機會，但對於過度診斷的合理擔憂，已經促進在不同的實驗室和不同的管轄區內實行了不同的替代性方法。

在應用虛擬基因panel的方法分析WES或WGS數據時，需要在以下二者間求得平衡，即panel範圍的設定是限定在與患者特定表型直接相關的高度特異性、保守的基因集內，還是包括與患者表型相關的系列疾病所包含的更廣泛的基因集（例如，是僅局限於對癲癇相關基因的檢測，還是包括所有與神經發育障礙相關的基因的檢測）。

小panel 在臨床上是非常有吸引力的，因為它減少了目標外冗餘數據及預期外結果的可能，但由於遺傳的異質性，其應用極易導致漏診。

然而，每個個體中存在的良性遺傳變異的數量，以及每個基因組數據64的解讀潛力意味著過度解讀導致過度診斷的可能性是相當大的，且這種情況的出現隨著檢測的範圍的增大而增加。

目前尚不清楚如何最好地調整基因組的分析，以達到最大限度地識別真正的致病性變異，儘量減少對誤導性變異的識別。

一般很少對特定檢測的靈敏度和特異性進行記錄或比較，因為這些結果取決於許多因素，包括患者是否最終確診、所討論表型的基因組證據，以及來自正常人群的對比數據的可用度。

在臨床實踐中，檢測數據之間並不能常規地進行互相比較。

4

先證者模式和Trios家系模式的檢測

對WES或WGS檢測得到的分子遺傳變異進行分析的一個很好的策略即是使用家系Trios模式分析患兒及其生物學父母的樣本。

這使得良性的家族罕見變異可以被過濾掉，僅出現在患兒身上的新發變異可以很容易被識別，隱性疾病或印記疾病的變異狀態可通過遺傳模式進行確定。

對於父母雙方都沒有受到與孩子同樣疾病影響的家庭，父母-先證者（Trios家系模式）的測序分析比單獨孩子（先證者模式）的測序分析，可以減少大約十倍的候選變異數，並提高了50％的診斷率(FIG. 2c),從而大大提高了達到精確診斷的可能性和加快了達到精確診斷的速度。

需要對這種分析效率的提升與其所帶來的患者父母測序額外成本的增加進行權衡，但是其所增加的費用成本，往往被需要共分離家系驗證分析的候選變異數目的減少而抵消，而這種共分離驗證對於先證者模式卻是必不可少的。

（譯者註：隨著測序成本的下降，trioWES的成本逐漸降低，在中國已出現了和Panel價格倒掛的情況，從而更加凸顯了trioWES的價值）。

對於使用常規基因檢測無法診斷的、表現為嚴重發育障礙的患兒進行Trios模式（標準家系，即先證者及其父母共三人）WES篩查，目前診斷率約為40%, 而在所有基因檢測方法中，該模式對這些表型多樣、難以解決的疾病的總體診斷率超過50%。

Figure2 | 臨床上的遺傳異質性與基因組檢測策略

a| 應用於臨床遺傳學的基因組分析方法，從使用光學顯微鏡觀察染色體進行基因組拷貝數分析的傳統方法，發展到全基因組測。

隨著檢測解析度的提升，可檢測到的變異數量也隨之增多。

雖然能檢測到的變異數量的增加可以提高各種疾病的診斷陽性率，但同時也大大增加了檢測到偶然發現和臨床意義不確定的變異的可能性。

b| 疾病表型的特異性越低，其越可能由很多個基因的變異導致，即遺傳異質性隨著表型特異性的降低而升高。

如果疾病的表型和/或遺傳同質性很高，則對單個或少量基因進行檢測可能更為適當。

而在表型和/或遺傳異質性較高的情況下，可能需要對數百上千的基因進行檢測，這樣平均每個患者將有數千個基因變異的檢出量。

全外顯子測序（WES）和全基因組測序（WGS）是表型未知情況下的最佳檢測策略，可用於診斷各種疾病。

c|需要在測序策略的診斷潛力和其實用性與成本之間尋找平衡。

如圖示，目前已報導的通過不同NGS方法檢測的先證者數量繪製於X軸，所覆蓋的基因組百分比用Y軸log10 的值表示，診斷率則來自公開發表的文章。

利用Trios策略的WGS診斷陽性率最高，數據信息量最大，但其費用也最高，因此可參考的相關報導很少。

鑒於目前已知的致病性基因變異大多位於基因編碼區，在嚴重智力障礙疾病的診斷中，WES策略相對WGS僅在診斷陽性率上有少許降低（從約42%降到40 %），但檢測的費用成本大大減少。

另一方面，雖然用僅對先證者進行檢測（proband-only）的策略取代核心家系 （trio）策略是可行且經濟的，但代價是診斷陽性率的顯著下降（譯者註：從trioWES的40%降低到先證者模式WES的僅約28%），這主要源於新發de novo變異和等位基因的反式雜合變異往往不能通過僅先證者檢測的模式（proband-only）直接判別。

對基因panel或單個基因的NGS測序是最常用的方法，但是診斷率很大程度上依賴於對表型和患者的考察。

這取決於臨床表型同某種可檢測的基因變異之間的相關性和有多少比例的該疾病表型的患者可以用該疾病已知的致病基因來解釋。

（見FIG. 1）。

N/A表示不適用。

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