余永國博士：NGS助力遺傳病研究及診療發展

余永國 博士

嘉賓簡介：

余永國，兒科學博士，副主任醫師，副研究員，碩士生導師，上海交通大學醫學院附屬新華醫院兒科內分泌/遺傳科副主任醫師，同時兼任上海市兒科醫學研究所分子診斷平台負責人、課題組PI，浦江學者,美國哈佛大學博士後。

近年來，余永國承擔多項國家級及市級課題；發表SCI論文30餘篇(總影響因子>100分)，回國後，成功搭建了基因晶片和二代測序診斷與研究平台。

隨著醫療技術水平的提高，人類的疾病譜已發生了巨大的變化。

近些年，國內新生兒死亡率持續下降，而出生缺陷問題卻日益凸顯。

神經發育障礙、遺傳性代謝病、重要臟器結構畸形等嚴重影響嬰幼兒的生存和生活質量，成為導致兒童死亡和病殘的主要原因。

這些病童如同來自遙遠的外太空，就像「星星的孩子」，承受著其脆弱的身體不可承受之重，精準診斷及治療兒童遺傳病成了至關重要的一環。

在基因測序技術蓬勃發展的當下，基因測序市場日益繁榮，基因技術改變了傳統的醫療觀念，也為遺傳病的檢測提供了更加簡便而有效的手段，NGS等新興技術也發揮著愈發強大的作用。

日前，測序中國專訪了上海交通大學醫學院附屬新華醫院、上海市兒科醫學研究所余永國博士。

面對兒童遺傳性疾病日益嚴峻的形勢，余永國博士暢談了當前遺傳病的診療現狀，就NGS數據的解讀、數據共享以及遺傳諮詢等熱點問題發表了獨到的的見解，並就測序技術在遺傳病中的應用進行了詳細的臨床案例分析。

顛覆「試錯模式」，邁向精準時代

測序中國：能否向大家介紹一下您的團隊，以及新華醫院兒科研究所主要針對哪些人群進行遺傳研究或檢測？

余永國博士：我們團隊是上海交通大學醫學院附屬新華醫院，上海市兒科醫學研究所兒童內分泌/遺傳科，我們科室分成四個平台——醫生平台、生化平台、分子平台和細胞平台。

醫生平台目前有11位內分泌/遺傳科的醫生，一方面主要負責兒童內分泌遺傳代謝性疾患、遺傳諮詢、兒童遺傳及產前諮詢等診斷和治療，另一方面負責實驗室報告的審核和簽署；生化平台主要進行特殊生化檢測，包括新生兒篩查，血、尿串聯質譜，代謝性疾病的酶學測定（戈謝病、粘多糖、腦白質病及溶酶體病等）以及檢驗科不開展的特殊激素和生化檢測等；分子平台主要負責患者的分子診斷和產前診斷，包括一代測序（Sanger）及其衍生技術、新一代測序（NGS）技術和基因晶片技術等；細胞平台主要負責孕婦無創產篩、羊水培養、染色體核型、FISH檢測等。

目前，我們的團隊主要針對兒童內分泌遺傳病因比如矮小、性早熟、性腺發育不良，代謝性疾患如胺基酸代謝、有機酸代謝、糖代謝及脂肪代謝障礙性疾患，兒童出生缺陷的遺傳病因及產前遺傳諮詢等領域進行研究、診斷和治療。

測序中國：在您的實驗室，哪些疾病可以通過NGS技術受益？

余永國博士：傳統的遺傳性疾患診斷策略是「試錯模式」，醫生必需預先診斷，再通過基因檢測驗證，由於不同的醫生對不同的疾病認知不同，同樣的患者在不同的醫生那裡得到的診斷和檢測差次不齊。

隨著現代生物醫學新技術，尤其是NGS技術在臨床研究中的應用，傳統的診斷策略將被顛覆，診斷模式可以一步到位，變得更加精準，無需醫生預先診斷，篩查結果會提示疾病表型，適用範圍擴大到人類數千種遺傳病，甚至可發現新的疾病，診斷過程也轉為由里到外，先篩查基因，得到答案，再用其他實驗室檢查驗證。

比如對於內分泌常見的疾患，如兩性畸形和尿道下裂，傳統來說我們的思路是綜合患者的外觀性別、激素性別、器官性別、基因性別、基因突變分析及心理性別來進行綜合判斷。

但實際上導致性腺發育不良的基因眾多，目前已知的就有200~300個，傳統的診斷思路不可能一下子就通過臨床和生化檢測判斷是哪個基因導致的。

所以在很長一段時間中，傳統的診斷思路就是「試錯」，通過一代測序先檢測一個基因，如果結果是陰性再檢測另外一個基因，然後以此類推，反覆檢測。

這種傳統的「試錯」模式不但延緩了診斷時間，而且需要反覆取樣，既增加病人的痛苦又提升了檢測成本，同時也需要技術人員進行重複勞動。

隨著NGS技術的發展，這個弊端會消除，通過基因Panel測序或者全外顯子測序，只需要一次取樣並進行一次實驗，就可以將目前已知的導致性腺發育不良的200~300個基因，甚至全基因組層面與遺傳病相關的幾千個基因，乃至新的致病基因都挖掘出來。

這不但可以在成本可控的前提下提高通量，而且一次取樣就可以得到大量信息，極大減輕了患者痛苦，加快了由樣本到報告的流程，為進一步治療爭取到了寶貴的時間。

所以NGS可以說是現階段可以使用，未來也更值得期待的技術。

數據分析：不容忽視的「最終環節」

測序中國：對於NGS從前期樣本製備到測序及數據分析，您怎樣評價目前市面上的相關產品，在這些環節中您最關注的是什麼？

余永國博士：NGS涉及的流程眾多，主要包括三個大的環節：建庫和捕獲、測序、數據分析。

在建庫和捕獲環節中，相關產品眾多，如在兒童遺傳病領域，有全外顯子相關產品，也有基因Panel等，目前主流的有Illumina的TruSight-One和全外顯子組建庫產品、Agilent的全外顯子組和常見遺傳病產品、Roche的NimbleGen全外顯子組、IDT的全外顯子組等相關產品等。

這些產品在臨床診斷功效上大同小異，其設計主要基於目前我們對已知疾病、資料庫及文獻的認知，比如Illumina的TruSight-One，其所涉及的4800多個基因涵蓋遺傳病、代謝病、腫瘤、心臟病、血液病、癲癇、感官及其他神經退行性疾病。

其基因組目標片段是根據多方面的信息確定的，包括人類基因突變資料庫（HGMD）、在線人類孟德爾遺傳資料庫（OMIM）、GeneTests.org網站、Illumina TruSight系列測序組合及市場上其他的測序組合試劑盒。

綜合這些來源的數據，一次檢測基本可以覆蓋目前臨床研究背景下關注的重要基因。

兒童遺傳病新一代測序環節現在市面上主要使用的是Illumina和Thermo Fisher公司的測序儀器和相關試劑，性能占優且占市場絕對領導地位的是Illumina公司。

以TruSight-One搭配不同通量的Illumina測序平台為例，MiniSeq及MiSeq一次運行可以做3個樣本，剛好是一個家系，可以滿足最基本的遺傳病研究。

如果樣本量比較大，可以選擇NextSeq或NovaSeq這種中高通量測序平台。

數據分析領域目前市面上參差不齊，比較混亂，有些廠家的解決方案自帶數據分析，還有眾多專門進行數據分析的公司。

我最關注的正是數據分析領域，因為這個領域是最終解決問題的環節。

從全外顯子角度，每一個人大約都攜帶幾百個和正常人不同的罕見變異。

對於臨床醫生，不能以一個患者的任何一個變異，貌似和臨床有些符合就斷定某一疾病，給孩子和家庭扣上遺傳病的帽子，這會造成很多的「冤假錯案」，也給患者帶來不必要的痛苦。

任何一個變異，都需要從臨床表型、生化檢測、遺傳規律、致病性等多個方面綜合考慮。

此外，我還很關注資料庫的共享。

當前，不同實驗室的數據以及不同醫院的數據，都是一個孤島，沒有很好的共享機制。

這導致同一患者在不同的地方重複進行相同的檢測，也導致同類的疾患做同樣重複的驗證工作，造成極大的人力和財力的浪費。

測序中國：您在生物信息分析方面有自己專業的隊伍，他們做了非常出色的工作，也開發了一些軟體，可否簡要介紹一下您的團隊在數據分析方面的獨特優勢或者經驗？

余永國博士：在NGS領域，我們主要依靠自己的生物信息團隊所建立的Pipeline，目前主要由兩個海外博士負責，一個是荷蘭萊頓大學醫學中心人類和臨床遺傳學中心的博士和博士後，有Nature Genetics和美國人類遺傳等頂級刊物的一作論文，另外一個是美國Emory大學的神經學博士，也有Nature Neuroscience一作的論文，他們兩個在NGS和基因晶片領域有著極其豐富的經驗和體會。

同時，我們的團隊擁有豐厚的臨床資源，可以說形成了「醫生→技術員→平台工作人員→患者」的一體化團體。

我們現在的NGS流程是，技術員先進行建庫和捕獲後測序，數據產生後運行Pipeline，然後由平台人員進行兩個獨立的複審討論匯總。

對於我們的NGS分析，其最大的特色是遺傳學臨床醫生的判斷，匯總後的變異需要經過臨床醫生尤其是開單醫生的複審和確認，然後再進行一代測序驗證，這樣的變異是經過臨床論證和檢驗的，所以結果可靠。

遺傳諮詢發展迅猛，未來值得期待

測序中國：您利用外顯子測序開展了非常出色的研究，您能否就NGS在其他應用方向比如轉錄組測序、甲基化測序以及全基因組測序在臨床研究中的潛力談談您的看法？

余永國博士：因為我主要專注於兒童出生缺陷的臨床應用研究，所以更多地關注DNA水平、基因Panel等。

目前，外顯子和全基因組的應用較多，但是轉錄組、甲基化等領域的NGS應用及發展也非常迅猛，但是目前還是主要應用於基礎研究，離臨床診斷和應用還尚有距離。

測序中國：您曾於美國哈佛大學醫學院進修分子診斷多年，這段經歷帶給您最大的收穫是什麼，有什麼一直影響至今？根據您豐富的臨床經驗，是否可以分享一下怎麼將新技術與中國獨特的大量樣本資源及大量數據充分結合，產生最大的價值？

余永國博士：相較於國內，國外的遺傳體系和制度非常成熟。

有相應的專業和職稱體系，有成熟的醫生、實驗室及產品以及儀器考核和認證系統，在這些方面國內還很欠缺。

但是目前國內有大量的病人資源，現在國內的遺傳諮詢培訓、技術培訓、第三方檢測公司、國外遺傳機構、遺傳醫師體系和職稱等蓬勃發展，大家都是想把國內的遺傳事業做大、做強。

相信在不久的將來，中國內地遺傳病的研究將是世界遺傳事業的主戰場之一。

測序中國：您怎樣看待中國目前精準醫療的發展？在您看來，NGS技術在未來將對臨床診療產生怎樣更多的影響？針對目前國內遺傳諮詢醫師的相對匱乏的現狀，您有怎樣的個人理解？

余永國博士：現在精準醫學的概念十分火熱，可謂「如火如荼」，甚至被炒作得較為嚴重。

當前，有院士層面的大精準：綜合環境、生化、DNA水平、RNA水平、蛋白質水平、甲基化水平、藥物反應等因素，這個精準聽起來非常「高大上」，但是實施起來卻非常困難；也有實際應用的精準：精準的分子診斷，藥物靶點等；當然還有個別具有「忽悠」成分的商業精準，如個別意義不明的腫瘤體檢、健康體檢等。

不管是什麼樣的精準及分子技術，但不可否認的是NGS高通量技術已經走入了我們的生活，相信在不久的將來，基因診斷會像我們現在的胸片、血常規一樣，成為各個專業領域和方向的常規檢測，成為有效診斷疾患的強大武器。

目前中國遺傳諮詢市場發展迅猛，這是非常好的事情，有助於培養專業團隊和人才，做大市場，但也需要不同的人群分工協作。

首先，對於遺傳諮詢醫師，這需要衛計委、中國醫師協會、國家考試中心聯合，先解決專業代碼和職稱體系。

目前已經有了醫學遺傳學專業，並列於內科、外科和兒科，但是沒有遺傳醫師這個職稱體系。

那麼問題就來了，醫學遺傳學專業的學生進入臨床崗位，不能晉升，只能通過其他體系比如兒科體系、內科體系、檢驗體系晉升職稱，這無疑限制了醫學遺傳學的發展。

有了專業和晉升體系，後面就是建立題庫和培訓師資及專科人才的培養，這樣遺傳諮詢醫師才能和國外一樣形成規模並系統化。

其次是遺傳諮詢師，主要服務於遺傳諮詢醫師、第三方檢驗公司及患者的遺傳諮詢，目前國內對這一領域的關注度很高，其發展還是很好的。

此外，未來還需要國家藥監局和相關的質控中心的積極合作，以解決試劑和儀器的認證問題。

國內和國外的體制不一樣，如美國是採用實驗室資質認證，只要實驗室有資質就可以開展各類檢測，而國內需要經過主管部門的審批，而這個審批要考慮人員的資質、場地的資質、試劑的資質和儀器的資質，即使四證齊全，除此之外，還需要有收費代碼。

這樣繁瑣的流程導致目前很少有NGS產品能合法合規地在國內大規模應用，這也在無形中限制了其發展。

最後，在醫療保險方面，目前分子診斷的檢測費用較為昂貴，如在美國等已開發國家，這些昂貴的檢測大多由保險覆蓋，但中國目前都是由患者買單，這也相對制約了新技術的發展。

測序中國：感謝您接受我們的專訪！

余永國博士：謝謝！

在專訪後，余永國博士還就測序技術在遺傳病中的應用進行了詳細的臨床案例分析，以下為案例分析的詳細內容。

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實際案例分享一：對單基因病臨床表現不明顯的補充確診

男孩，9歲，身高121.5cm（矮小），體重27.8kg；出生史無特殊；1歲會走路，2歲會說話，3歲上幼兒園；5歲時家長感覺明顯退步；就診時表達意思不清楚，好動，不與人溝通，不會寫字；輔助檢查：8歲IQ小於40；染色體正常；血尿串聯正常；甲狀腺功能正常，生長激素完全缺乏；MECP2 Rett綜合徵基因檢測未見異常；基因晶片檢測未見異常；脆性X綜合徵未見異常；在某醫院給予幹細胞腦注射治療，效果欠佳，9歲時智力接近於0；輔助檢查：腦電圖正常；腦MRI：右額葉多發軟化灶，雙側腦室寬，腦溝增寬。

像這樣的疾患，臨床表現不典型，從疾病的認知角度不知道是什麼基因的變異，通過Illumina測序平台檢測後發現是不典型的III型粘多糖：

並經過一代測序和酶學確診。

實際案例分享二：對複雜疾患的精準診斷：

對於不明原因及一時沒有診斷思路的患者，NGS是一個很好很強大的武器。

患兒，女，1歲3月就診；發育遲緩，眼瞼下垂，有先心史；出生時有青紫吸氧史，BW 3.5；身高＜-3SD，體重＜-2SD；頭圍正常，特殊面容（雙眼上瞼下垂，遮蓋上1/4瞳孔），心前區Ⅲ°收縮期雜音；心彩超：房間隔缺損（Ⅱ，篩孔樣）；二尖瓣病變伴輕-中度反流；三尖瓣病變伴中度反流；左右心室壁稍肥厚；肺動脈高壓；GESELL提示發育稍落後（動作能DQ粗74細99；應物能DQ89；言語能DQ80；應人能DQ89）；染色體正常；尿粘多糖定性電泳：弱陽性，DS區帶；酶活性檢測陰性；全基因組晶片檢測陰性。

初步診斷：矮小；發育稍落後；雙眼上瞼下垂；先心（房缺、瓣膜病變、室壁肥厚，肺動脈高壓），有家系血。

通過前兩個案例我們不難發現，都是在沒有典型臨床表現，以及經過傳統方法檢測後仍然沒有診斷思路的情況下，最終通過NGS獲得了精準的信息，打開局面，再用其他方法驗證，最終明確診斷思路及下一步方案。

實際案例分享三：不能過分的依賴高通量測序

但是我們也不能過度的依賴高通量測序，而丟失了我們基本的醫生診斷思路。

患兒，男，14個月；身高78.2cm（正常），體重10.7kg（正常）；智力正常；骨骼無畸形；體型勻稱；面部外觀正常；染色體46，XY；尿道下裂，生殖器外觀異常，尿道開口於陰囊水平；新生兒篩查17羥孕酮（17OHP）高278（正常值低於30）；電解質正常，ACTH 231（高），皮質醇8.95（低）；皮膚黑，出生後一直按照腎上腺皮質增生症（CAH）給予口服9a氟氫可的松和醋酸氫化可的松治療至今，控制可，皮膚顏色正常，生化在正常值範圍；腎上腺超聲波未見腎上腺皮質增生；睪丸超聲波質地欠佳，13X7X9，未見卵巢；有一姐姐，新生兒篩查17羥孕酮高；19個月因一次發熱後抽搐，腦炎肺炎死亡。

問題是這個患者：腎上腺皮質增生症診斷是否成立？尿道下裂如何處理？治療有什麼措施？後續如何進一步診治？

這個患者在外面先後做了幾次基因檢測，第一次是392個相關代謝病Panel，呈陰性：392個代謝病相關Panel未見致病性變異；CYP21A2未見變異，CPY11B2隻發現一個變異位點，AR疾患；其他變異位點臨床不支持。

然後擴大做了764個代謝病基因全面篩查Panel，未見致病性變異：CYP21A2隻發現一個變異位點。

然後繼續更換方向，做了219個性發育基因的Panel，未見致病性變異：CYP21A2未見變異，HSB3B2隻發現一個變異位點，AR疾患；其他變異位點臨床不支持。

最後做了全外顯子，也是陰性。

事實上根據臨床表現和生化特點，導致17羥孕酮高而且還有尿道下裂的只有HSD3B2基因突變導致的3B-羥類固醇脫氫酶導致的CAH，以及POR基因突變導致的細胞色素P450氧化還原酶。

而患者沒有骨病表現，所有患者只能是HSD3B2基因突變導致的3B-羥類固醇脫氫酶導致的CAH，那麼問題就簡單了，現在發現了HSD3B2基因一個位點突變，而這個疾患是常隱的疾患，存在缺失的可能，我們最後做了一個QPCR就證明了這件事情。