「非洲豬瘟：發現與診斷」非洲豬瘟的實驗室診斷

由於非洲豬瘟缺乏預防用疫苗，為防止疫病的傳播，就需要實施嚴格的衛生和生物安全控制措施，而這就依賴於疫病的快速、可靠的早期診斷。

ASF 的診斷是指確診動物正在感染，或者曾經感染過ASFV。

因此，適用的診斷技術包括檢測和識別ASFV特異性抗原、DNA或抗體的技術，所獲取的檢測信息也是控制和根除計劃的重要保障。

在選擇診斷技術時，分析疫病感染期非常重要(圖1)。

由於感染動物所處的感染期不同，因此在疫情和控制根除計劃中，需要同時檢測病毒和抗體以確保準確性。

根據報導，ASF 的自然感染潛伏期為4~19天。

在臨床症狀出現的兩天前，ASF感染動物開始散播大量病毒。

病毒散播因所感染的ASFV毒株毒力不同而異。

感染後約7-9天血清轉陽，抗體陽性可持續終生(圖1)。

圖1

病原學檢測為陽性(即抗原)則表明，所檢測的動物在取樣時正在發生感染。

而抗體檢測陽性則表明感染正在或者已經發生，包括感染後已經恢復的動物(且可能終身保持血清陽性)。

自2015年底以來，東歐血清學流行病學調查數據顯示血清學陽性動物的檢出率顯著增加，特別是在發生疫情的歐盟國家的野豬群體中尤為明顯。

這些結果表明，ASF感染耐過動物可存活超過一一個月並可能出現亞臨宋感染的病例，就像在伊比利亞半島、美洲和非洲之前所描述的情況。

因此，抗體檢測技術對於實施控制和根除計劃所需的完整信息而言是必要的。

非洲豬瘟病毒檢測

應用聚合酶鏈式反應(PCR)檢測非洲豬瘟病毒基因組

PCR已成功應用於豬樣品(血液、器官等)和蜱中ASFV基因組的檢測。

病毒DNA片段通過PCR擴增獲得足以檢測的量，從而實現檢測。

所有經過驗證的PCR技術均可以在臨床症狀出現前實現檢測。

PCR能在樣品到達實驗室數小時內，完成ASF的診斷。

PCR是可以代替病毒分離鑑定的一種靈敏、特異、快速的ASFV檢測技術。

同時，相比於抗原檢測技術，如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和直接螢光抗體測試(FAT) ，具有更高的敏感性和特異性。

需要注意的是，PCR的高度敏感性使其容易發生交叉污染，應該採取適當的預防措施來減少和控制污染風險的發生。

OlE在《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》(2016 年)中推薦使用的常規和實時螢光PCR得到了長期的充分驗證，是常規診斷的重要工具。

此外，除了OIlE推薦的適用於康復動物ASF基因組檢測的實時螢光PCR技術外，其他研究者建立的實時螢光PCR已經證實更為敏感。

在這些分子技術中使用的引物和探針多以VP72編碼區域作為靶基因設計，該基因片段是ASFV基因組中研究清楚，且高度保守的區域。

應用這些PCR技術，即使在滅活或降解的樣品中也可檢測到已知所有22種p72病毒基因型的多個毒株。

對於特急性、急性或亞急性ASF感染病例，PCR 是首選的檢測技術。

此外，由於PCR檢測病毒基因組，即使病毒分離鑑定為陰性的、含有無感染性病毒粒子的樣品，也可完成檢測，這也使其成為用於檢測感染低或中等毒力毒株的重要工具。

雖然聚合酶鏈式反應(PCR)不能提供病毒感染性的信息，但可以提供定量的信息。

非洲豬瘟病毒分離

病毒分離是將樣品接種易感的豬源原代細胞、單核細胞和巨噬細胞而進行的檢測。

如果在樣品中存在ASFV,則會在易感細胞中複製，在感染細胞中產生細胞病變(CPE)。

細胞裂解和細胞病變(CPE)通常在出現紅細胞吸附現象的48-72小時後發生。

ASFV的紅細胞吸附試驗是該病毒特有的檢測技術，其他豬源病毒在白細胞培養物中不存在紅細胞吸附特性。

當病毒在這些培養物中複製時，多數ASFV毒株會產生紅細胞吸附反應(HAD)，在感染的白細胞周圍吸附豬紅細胞形成「玫瑰花環」(圖2)。

圖2

此外， 需要說明的是，在沒有發生紅細胞吸附反應的時候出現CPE, 可能是由於接種物的細胞毒性所致，或者由於其他病毒如偽狂犬病毒的感染，或者由於不產生紅細胞吸附反應的ASFV毒株導致。

旦發生這類情況，必須採用其他的病毒學檢測技術如FAT或PCR，檢測細胞沉澱物是否存在ASFV。

而如果細胞分離沒有觀察到任何變化，或者FAT和PCR檢測為陰性，則需要將細胞培養上清-再次接種新的培養物種，連續傳代3-5代，之後方可確認為ASFV陰性。

對於抗原檢測(ELISA、 PCR或FAT)為陽性的樣品，推薦HAD為完成病毒分離和鑑定的參考試驗。

而如果通過其他方法已經證實ASF感染，特別是在首次暴發ASF的地區，也建議使用紅細胞吸附試驗鑑定病毒。

此外，病毒分離對於進一步的分子生物學研究也是必要的基礎。

直接螢光抗體法對非洲豬瘟抗原的檢測

FAT可用於檢測豬組織中的ASFV抗原。

檢測原理是通過顯微觀察感染臟器塗片或薄層冷凍切片，上的病毒抗原實現的。

使用異硫氰酸螢光素(FITC) 結合的特異性抗體檢測細胞內抗原。

FAT 也可用於檢測未觀察到HAD的白細胞培養物中的ASFV抗原，因此可以鑑定不產生HAD反應的ASFV毒株。

FAT 還可用於鑑別CPE是由ASFV感染導致的，還是由其他病毒感染或者導致的接種的細胞毒性導致的。

陰陽性對照是保證切片被正確判定的重要保障。

該方法也是對特急性和急性ASF病例的高度敏感的檢測技術，且可以非常快速的完成檢測。

雖然FAT 是高效的檢測技術，但目前已被PCR逐步取代，所需試劑也不再廣泛使用。

然而值得一提的是，在亞急性和慢性型感染中，FAT 的敏感性明顯降低(40%)。

ELISA對非洲豬瘟抗原的檢測

也可以使用EUISA檢測病毒抗原，其成本比PCR更為低廉，並且可在沒有特殊的實驗室儀器設備的條件下，短時間內對樣品的大規模篩查,然而，與FAT相似， 對於亞急性和慢性病例，抗原ELISA的敏感性明顯較低。

同時，現地樣品通常狀態不佳，因此也降低了檢測的敏感性。

因此建議抗原ELISA (或其他ELISA)主要用於「群體」檢測，並輔助以其他病毒學和血清學檢測。

非洲豬瘟抗體檢測

血清學檢測技術因其簡便、低成本和無需特殊的儀器設備，而成為最常用的檢測技術。

由於ASF尚沒有可用的疫苗，ASFV 抗體陽性即表明當前或者曾經發生了感染。

此外，ASFV抗體在感染早期即可出現，並持續數年。

然而，在特急性和急性感染中，豬通常在抗體轉為陽性前已死亡。

因此，在疫病暴發的早期階段，建議採集樣品檢測病毒DNA。

對於檢測ASF抗體，推薦使用ELISA篩查抗體陽性樣品, 並採取免疫印跡試驗(IB) 或間接螢光抗體(FA)試驗進行確認。

此外，間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術也可用作豬血清和組織滲出物中ASF抗體檢測的替代試驗。

該技術也適，用於大量樣品的檢測，而無需昂貴的螢光顯微鏡設備，且敏感性較高。

ELISA對非洲豬瘟抗體的檢測

ELISA是一種常用的檢測技術，廣泛用於多種動物疫病的大規模血清學調查。

該方法的顯著特點是靈敏度高、特異性好、速度快、成本低，結果清晰。

藉助於自動化設備的使用，可以實現大量樣品的快速篩選。

ELISA使用標記物檢測血清樣品中的ASF抗體。

ELISA使用的標記通常是某種酶。

當抗原和抗體彼此結合時，酶引起底物發生顏色變化，從而鑑定ASF陽性樣品。

目前，多種用於ASF抗體檢測的間接或阻斷ELISA已實現商品化供應，或者由實驗室「自主」建立。

血清處理或保存不當(儲存或運輸不當)，如溶血樣品可能會產生高達20%的假陽性結果。

因此，通過ELISA檢測的所有陽性和可疑樣品必須通過其他血清學替代試驗確認。

免疫印跡試驗(IB)技術是用於蛋白質檢測和鑑定的快速、靈敏的檢測技術。

IB技術的原理是抗原抗體的特異性結合。

IB 技術中使用了覆蓋有病毒抗原的紙條，首先是抗原溶解、電泳分離、以及轉移到薄膜上(通常是硝化纖維索膜)，之後與特異性一抗反應，再與標記二抗作用後，產生可直接觀察的陽性反應條帶。

ASFV感染後首先刺激機體產生抗體的多種病毒蛋白，通過在IB試驗，可在所有感染動物中標定地檢測到。

動物感染後7-9天血清轉陽，並可在康復動物體內存在幾個月。

接種其他病毒疫苗的動物血清，可能會產生非特異性反應，因此需要藉助於如IPT或者FAT等技術進行確認。

間接螢光抗體試驗(IFA)對非洲豬瘟抗體的檢測

該技術的原理是用具有細胞適應性的ASFV毒株，感染單層綠猴腎細胞，再通過特異性抗原抗體反應實現對ASF抗體的檢測。

抗原抗體反應通過耦聯的螢光素進行檢測。

陽性樣品在感染細胞的胞漿中出現特異性螢光。

IFA 是一種快速、高度敏感和特異的ASF抗體檢測技術，適用於血清、血漿或組織分泌物中抗體的檢測。

間接免疫過氧化物酶試驗(IPT)對非洲豬瘟抗體的檢測

免疫過氧化物酶試驗(IPT)是一-種細胞免疫化學技術，細胞固定後通過耦聯的過氧化物酶實現抗原抗體複合物的檢測。

在IPT反應過程中，綠猴腎細胞感染了適應於這些細胞的ASFV適應株。

感染細胞首先被固定，之後用作抗原以確定樣品是否存在針對ASF的特異性抗體。

與FAT檢測一樣，IPT 是具有高度的敏感性和特異性的快速檢測技術，適用於從血清、血漿或組織滲出液中檢測ASF抗體。

但因為採用了酶學顯色系統，其結果判定比FAT更為簡單。

綜上所述， 目前可用的診斷技術可通過綜合病毒和抗體檢測來確診ASF。

實時螢光PCR是最廣泛應用的病毒學診斷技術，可敏感、特異、快速的實現ASFV核酸的檢測。

由於存在交叉污染的可能，來自無疫區的單個動物(例如野豬)的PCR陽性，或在一-群動物中出現的單個PCR陽性樣品，應採取其他的病毒檢測方法， 以及結合血清學、病理學和流行病學調查的結果綜合確診。

由於PCR所檢測到的陽性是病毒核酸陽性，而不是感染性病毒粒子，因此，在PCR之外，強烈推薦新的意思感染地區。

在報告發生疫情前，先從感染樣品中分離獲得病毒以確認。

雖然經過驗證的ELISA是檢測ASF抗體的候選技術，特別是對血清樣品的初步篩查，但應時刻注意檢測的局限性。

應使用其他的確證試驗，如1B、 IFA 或IPT，以發現ELISA檢測中的假陽性樣品。

此外，IFA 和IPT是組織滲出液和血漿樣品檢測的首選技術，因為他們能完整展示流行病學過程，並可確定感染的具體時間。

ASF準確的診斷必須包括病毒學和血清學檢測結果，同時結合臨床、病理和流行病學的調查結果。

表5總結了ASF的主要實驗室診斷技術及其特性。