耳聾相關分子生物學研究

耳聾的病因複雜，是多種因素共同作用的結果，據報導有大約60％ 的耳聾和遺傳因素有關。

國外報導新生兒重度耳聾發病率大約O．8‰ ～1‰ ，而且其發病率隨時間和地域的不同而有所差異。

在我國新生兒耳聾發病率約為1‰～3‰ _2 ，60~70歲年齡人群發病率約為30％ ～5O％ 根據耳聾是否伴有其它器官臨床症狀分為綜合徵性耳聾和非綜合徵性耳聾，綜合徵性耳聾約占20％～3O％。

根據遺傳方式遺傳性耳聾分為常染色體隱性遺傳(autosomal recessive deafness，DFNB)、常染色體顯性遺傳(autosomal dominant deafness，DFNA)、伴性遺傳(x—linked deafne ss，DFN)和線粒體基因遺傳fm_tochond ria J deafness，DFNM)，其中DFNB大約占77％～88％，DFNA約1O％～2O％，DFN約1％～2％。

在不同的人群中，DFNM 因素變化非常大，約為1％ ～2O％ 。

隨著分子生物學技術的發展，與耳聾相關的基因的定位、分離、克隆及基因的突變得到深人的研究。

目前已經確定的和耳聾有關的基因超過1 2O個，據預測耳聾相關基因可能有大約300個或占總基因數的1％ 。

目前已經報導的和綜合徵性耳聾有關的核基因共32個，Alport Syn—d rome(3個)，Biotinidase Deficiency (1個)，B ranchia— Oto—Renal Synd rome(2個)，Je rvel&Lange—Nielsen Syndromef(2個)，Norrie Disease(1個)，Pendred Syndrome(1個)，Stickler Syndrome(3個)，Treacher Colins Syn—drome(1個)，Usher Syndromef(11個)，WaardenburgSynd rome(7個)。

非綜合徵性耳聾有關的核基因有42個，其中DFNA1 9個，DFNB20個，DFN 1個，DFNM2個。

目前已經確認的耳聾基因中，GJB3是於1 998年我國學者夏家輝自行發現並成功克隆的第一個耳聾致病基因，定位於人染色體1 p33~p35，該基因的突變包括一個錯義突變和一個無義突變，突變與高頻段的聽力損傷有關 。

我國的耳聾分子生物學研究起步較晚，早期國內的遺傳性耳聾相關報導大部分為家系的系譜分析，受技術手段的限制，沒有進一步的基因檢測；氨基糖苷類抗生素耳毒性的研究局限在對內耳組織，包括毛細胞，血管紋等的形態學觀察，以及對相關生化指標的檢測。

由於中國人口眾多，病例資源豐富，有條件進行大規模家系調查研究，近年來隨著分子生物學技術手段的進步，研究水平有了很大的提高。

1 綜合徵性耳聾相關研究

1．1 Alport綜合徵。

是以基底膜改變為特徵的家族性遺傳病，表現為血尿的同時伴有耳聾及眼部損害，又稱為眼、耳、腎綜合徵。

2000年國內廖志蘇報導6例AIport綜合徵病例，該病的主要遺傳方式為X連鎖顯性遺傳，約占5O％～85％，其次為常染色體顯性遺傳，占1O％～15％ ，常染色體隱性遺傳非常少見。

該疾病的致病基因COL4A5為Barker等於1 989年成功克隆，該基因編碼lV型膠原的a5鏈。

1．2 Usher綜合徵。

1 996年夏華報導兩例患者，症狀表現為進行性聽力減退伴視力下降，畏光，測聽表現為雙耳重度感音神經性耳聾，排除其它耳聾疾患，診斷為Usher綜合徵，即先天性聾視網膜色素變性綜合徵。

1．3 伴有耳聾的母系遺傳的糖尿病(maternally inheriteddiabetes mellitus w-fh deafnes，MIDD)。

國內1 995年，項坤三 等在非胰島素依賴型糖尿病患者外周血標本檢測到線粒體DNA 3243 A—G突變，認為這是非胰島素依賴型糖尿病的致病因素，並且其中部分病人伴有神經性耳聾表現。

張慶 等也對母系遺傳性糖尿病患者進行了相似的研究。

孔維佳 等對非綜合徵性感音神經性聾患者外周血白細胞線粒體DNA該缺失突變進行分析，並未檢測到該點突變，提示該突變在伴有糖尿病的耳聾病人中有較高的發生率，在無糖尿病史的我國非綜合徵性耳聾人群並不常見。

2 非綜合徵性耳聾的相關研究

2．1 核基因。

2．1．1 已經證實的基因突變。

2．1．1．1 連接蛋白26(C 26)基因突變的研究。

C26屬於間隙連接蛋白基因，編碼的間隙連接蛋白屬於膜蛋白，細胞間隙連接通道的組成部分，在信息傳遞和物質交換中起重要作用。

目前已經證實該基因家族中的C 2 6、C 3O、C 31、C 43突變可以引起非綜合徵性耳聾。

歐美地區先天性耳聾中2O％ 是由C 26基因突變所致，目前已有報導的致病突變最多見的是30delG或35delG，約占總突變的6O％～85％，而柯肖枚 等在中國人群未發現該種突變，提示C 26基因異常是遺傳性耳聾的主要致病基因，但突變存在種族差異，國人C 26基因的編碼區233— 235 delC純合性突變是導致遺傳性無綜合徵性耳聾的原因之一。

王苹等對21 9例不同的耳聾患者篩查，結果顯示中國人中C 26基因233delC突變的發生率為21．5％ 。

肖自安等對常染色體隱性遺傳性耳聾39個家系和常染色體顯性遺傳性聾3O個家系以及散發性先天性聾啞兒童1 6例進行PCR加SSCP檢測，結果發現一個常染色體顯性遺傳性聾家系存在299～300位鹼基AT雜合性缺失，導致移碼突變，並認為蒙古人種常染色體隱性遺傳性聾的C 26基因突變可能低於其它人種。

馮永等對一個遺傳性耳聾家系的檢測顯示C 26基因存在兩種鹼基改變，A34 1 G和GC257—258C G兩種情況，但這種突變並非致病性突變，僅是多態性表現。

鄭文波等對43例語前非綜合徵性聾患者的GJB2基因的測序分析顯示3種突變(235delC，1 76～ 1 91 del 1 6，299～3OO del AT)，兩種多態性(79G—A，GC 257—258 CG)，中國人中235delC突變是最主要的致病性突變類型。

2．1．1．2 C 58基因。

陸春葉等成功克隆出新的人類間隙連接蛋白基因，並定位於1 p32．3~p34．1。

1 2個常染色體顯性遺傳性聾家系未檢測到該基因突變，認為該基因突變可能不是引起常染色體顯性遺傳性耳聾的常見原因或與該疾病無關。

2．1．1．3 X連鎖隱性非綜合徵型耳聾。

家系報導，臨床表現為低頻的神經性聽力減退，遺傳方式符合X連鎖隱性遺傳規律。

在常染色體顯性遺傳非綜合徵性聾中，已報導的與低頻聽力下降相關的耳聾基因為DLAPH1和WFS1，分別位於5q31和4p1 6．1位點上。

但該家系表現與上述基因的表型相似，但結合DPOAE$1]ABR結果考慮為伴性遺傳，具有特殊性，有待於進一步研究，可能存在新的基因位點或基因。

2．1．1．4 進行性肌萎縮／神經性耳聾多肽因子樣基因DDPL(dystonla／deafness peptide like)。

夏家輝等利用生物信息分析技術，RACES1]cDNA文庫篩選克隆出的一個新的耳聾相關基因，l1 q22．1～22．2，(genebank號：DDPL2，AF165967)，長度5．4mb，與進行性感應神經性耳聾綜合徵致病基因DDP有較高同源性。

2．1．1．5 KCNQ4基因。

是一種新型的鉀通道基因，定位於人染色體1 a34上，僅表達在外毛細胞而不表達在內毛細胞和血管紋上，主要參與受刺激後毛細胞的鉀離子循環。

該基因受損後表現為常染色體顯性遺傳的學語後高頻聽力下降。

王秋菊等對一個家系的研究發現，該基因外顯子2和3之間內含子複製數的變化可能和耳聾有關。

2．1．1．6 Xp部分三體伴性隱性遺傳性耳聾。

家系報導，表現為先天性聾啞，其母染色體為4 6 X X，d U P (X)(p2200p2209)，部分三體，患兒染色體核型為46xy，dup(X)(p2200p2209)，部分三體，考慮為攜帶聾啞基因的X染色體定位片段單純重複。

未行進一步基因定位或克隆。

2．1．2 有待證實的基因突變。

2．1.2．1 為了解母系遺傳的非綜合徵性耳聾家系中，核基因和線粒體基因組之間的關係，劉寧生擔¨ 等使用DNApooling技術進行全基因組掃描，發現45個陽性位點，認為母系遺傳性耳聾的核基因遺傳是多基因遺傳的。

邢光前 等也有類似報導。

2．1.2．2 一個新的常染色體隱性遺傳非綜合徵性耳聾致病基因。

程琳 等應用純合子定位法進行一個表親婚配非綜合徵耳聾家系進行基因掃描，確定致病基因位於D1 7S 1 293附近，定位於1 7q1 1．2～1 2的D1 7S1 850SDD1 7S1 81 8之間的5．07cm區域，是一個新的致病基因位點。

2．1.2．3 一個可能的新基因座。

家系報導，一種新型的常染色體顯性遺傳無綜合徵性感音神經性耳聾。

該家系以典型的孟德爾顯性遺傳規律遺傳，無任何非聽覺系統症狀，結合臨床表現，通過連鎖分析，該家系的耳聾基因和先前已經報導的非綜合徵性常染色體顯性遺傳感音神經性耳聾的基因不連鎖 。

2．2 線粒體DNA。

線粒體是細胞能量代謝的來源，也是氧化磷酸化的中心，在保持細胞的正常功能中起重要的作用。

線粒體DNA是唯一一種細胞核外的遺傳物質，由於其獨特的遺傳特性：母系遺傳，具有半自主性，游離於基質中不與組蛋白結合，修復能力低下等，容易發生鹼基突變。

目前已有廣泛報導線粒體DNA的突變與神經性耳聾等神經肌肉衰退性疾病，老年化過程，腫瘤的發生、發展有密切關係。

近年來國內逐步增加了對線粒體DNA突變的認識，發現多種突變類型，包括點突變，鹼基插入或缺失以及大片段缺失突變等。

2．2．1 線粒體DNA4977bp缺失突變。

1 998年戴朴豫等利用巢式PCR技術(即以第一次PCR的產物作為第二次PCR的模板】從老年性耳聾患者顳骨火棉膠切片中檢測到線粒體DNA4977bp缺失，並經測序證實，提示該缺失可能和老年性耳聾有關。

韓維舉 引等對顳骨切片，腦組織，心肌，肝臟組織中的線粒體DNA4977bp缺失進行檢測，認為線粒體DNA4977bp缺失的發生和老化有關，內耳和蝸核組織中的該缺失和老年性耳聾的發生有關。

孔維佳 等在國內91、首次利用阿黴素成功誘導大鼠內耳組織線粒體DNA 4834缺失，並證實該缺失可以增加個體對氨基糖苷類抗生素耳毒性作用的敏感性。

趙輝 。

等通過大鼠動物實驗證實高膽固醇血症可以加劇大鼠聽力下降，聽覺器官線粒體4834缺失可能是其作用機制。

劉俊 等研究證實老年大鼠聽閾的提高與耳蝸組織中存在線粒體DNA4834大片段缺失有關。

吳海燕 等對老年大鼠的研究證實老年性聾耳蝸組織中存在線粒體DNA4834大片段缺失，並通過影響轉錄使COX活性降低。

孔維佳等分析非綜合徵性耳聾患者中線粒體DNA三種突變的表達，發現4977缺失可能是非綜合徵性感音神經性耳聾的重要因素。

韓維舉 等通過大鼠動物實驗，認為長期噪聲暴露可以引起耳蝸，蝸核及顳葉腦組織線粒體DNA4834缺失，線粒體4834缺失和噪聲性耳聾的發病有關。

由上述結論可見，線粒體DNA4977(大鼠相應為4834)較高頻率的缺失，並非某種疾病所特有，而是與多種原因引起的耳聾有關，因此可能是耳聾發病過程中的一個共有現象。

至於該缺失突變在內耳組織的發病機理仍不清楚，戴朴等認為內耳供血血管狹窄，內耳供血不足可能是造成4977缺失的重要原因之一。

2．2．2 線粒體DNA 1 555 A—G點突變。

該點突變是當前研究的熱點之一，國內1 998年開始相關研究。

該突變最早發現於對氨基糖苷類抗生素敏感的家系，和藥物性耳聾有關。

袁慧軍等對3個有明確氨基苷類藥物應用史的母系遺傳家系的研究發現，1 555A—G突變並非氨基糖苷類抗生素易感的唯一分子學機制。

柯肖枚等的研究也得出相似結論。

邢光前等對一個遺傳性聾家系的研究顯示線粒體DNA 1 555A—G突變是導致該家系聽力損傷的內在因素。

王力紅 引等對西南地區氨基糖苷類藥物致聾的調查發現在我國氨基糖苷類抗生素藥物性耳聾患者中約3O％ 有母系遺傳家族史，線粒體DNA 1 555 A—G突變有較高檢出率，是影響藥物易感性的重要因素。

徐霖 等證實氨基糖苷類抗生素敏感病人的外周血和頭髮中同樣存在線粒體DNA 1 555A—G突變，可以使用頭髮替代外周血進行基因突變篩選。

2．2．3 7445A—G突變。

研究較少，劉玉和等對1 28例非綜合徵性耳聾家系成員和1 33例散發非綜合徵聾患者進行突變分析，均未檢測到該缺失突變， 因此認為在我國非綜合徵性耳聾患者，7445A—G突變發生較少，明顯低於1 555 A—G突變。

2．2．4 線粒體DNA突變的致病性仍不明確，目前僅是推測某些突變可能和疾病的發生存在相關性，而且在同一個體，可能同時存在多種不同的突變現象，致病性可能是多種突變因素共同作用的結果。

孿為民 等對1 2個非綜合徵性耳聾家系調查結果顯示個體組織同時存在線粒體1 555A—G突變或7445A—G突變及1 6sRNA基因突變，兩種突變共存則增加對氨基糖苷類抗生素的敏感性。

3 展望

國內對耳聾有關的分子生物學研究近年來有著長足的進步，但與國外相比仍有相當的距離。

國內獨具的優勢是豐富的耳聾疾病基因資源，可以開展大規模基因突變篩查，充分利用現有的技術手段，如PCR，SSCP，基因克隆技術，重組技術，DNA pooling，基因晶片技術等，有可能發現中國人特有的耳聾相關基因或突變類型，這應該是一個未來的研究方向。

基於目前對線粒體DNA的研究成果，進一步了解線粒體DNA突變的發生機制，對機體生理過程的影響，致病的機理，以及核基因對線粒體DNA的調控信號傳導途徑等也具有重要意義。

此外，基因的突變最終將影響細胞內各種蛋白質的合成，引起細胞的結構、功能改變，耳聾相關蛋白的研究亦具有廣闊前景。

總之，對耳聾發生、發展的分子水平變化過程的認識，最終將為耳聾相關的基因治療手段的實現提供理論基礎。