參加《精液分析外部質控及標準化操作培訓》總結與思考

袁長巍 北京國衛生殖醫院

12月8日，由中華醫學會生殖醫學分會精子庫管理學組、國家衛生計生委男性生殖健康重點實驗室/男性臨床研究室（國家衛生計生委科學技術研究所、WHO人類生殖研究合作中心）共同主辦的2017年精液分析外部質量控制暨《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》標準化操作培訓在北京開班，本人有幸參加。

「理論結合實踐，質控貫穿始終」是本次培訓的特色。

嚴格遵循WHO手冊進行規範化操作，緊張而豐富的培訓過程讓每一位學員都充分認識到精液標準化及質量控制的重要性，同時也為日後的工作奠定了基礎，啟迪了思路，可謂感觸頗深，收益匪淺。

據國家衛生計生委科研所盧文紅教授介紹，目前為止全國已有5000餘臨床及專業技術人員參加理論授課，1200餘人接受了實驗室操作培訓，為精液質量的標準化操作和質量控制打下了堅實基礎。

現將本次培訓後的體會闡述如下：

一、重視PDCA循環

授課過程中先後有四位老師提到了PDCA循環，其重要性不言而喻。

PDCA循環是將質量管理分為四個階段，即計劃（plan）、實施（do）、檢查（check）、處理（action）。

PDCA循環是全面質量管理所應遵循的科學程序，每一項工作都需要經過計劃、實施計劃、檢查計劃、對計劃進行調整並不斷改善。

PDCA循環是爬樓梯上升式的循環，每轉動一周，質量就提高一步，特別是在質量管理中得到了廣泛的應用。

PDCA循環關鍵在於總結階段，總結經驗，肯定成績，糾正錯誤，是推動PDCA循環全面提升實驗室管理水平和技術能力的關鍵所在。

二、精液標準化操作的重要性

所謂的標準，就是儘可能地將相關操作步驟進行細化，量化和優化，細化，量化和優化的度就是在正常條件下大家都能理解又不會產生歧義。

精液常規分析SOP是一種操作層面的程序，是實實在在的，具體可操作的，精液分析的各項操作都有嚴格的時間控制，規定時間內完成可有效減少誤差的發生。

SOP的精髓就是把一個崗位應該做的工作進行流程化和精細化，使得任何一個人處於這個崗位上，經過合格培訓後都能很快勝任該崗位。

所以，嚴格遵循精液標準化操作流程是獲取可靠結果的重要保障，其流程主要包括以下幾方面：

1．初步肉眼觀察：精液通常15分鐘精液標本完全液化，60分鐘未完全液化應作記錄，不液化標本需進行機械混勻或酶消化；粘稠度應與不液化進行區分，拉絲度不超過2cm；精液外觀呈均質、灰白外觀，精子濃度低、細胞少呈透明狀；黃色、紅色精液應注意禁慾時間、疾病及藥物的影響；精液體積測量應用稱重法；pH值測定應選取範圍在6-10的試紙，正常應大於7．2。

2．顯微鏡初檢：精液充分混勻，10倍下觀察是否存在粘液絲；精子的聚集和凝集應注意區分；精液中如發現大量圓形細胞應進行染色區分，白細胞考慮炎性存在，生精細胞增多考慮睪丸生殖功能受損。

3．精子存活率評估：死精子一定不動，但不動的精子未必都是死精子，精子存活率檢測非常重要。

伊紅染色觀察誤差較大，應用伊紅-苯胺黑染色提高了辨識度和準確性。

4．精子活力評估和精子計數：精液混勻後，嚴格按照SOP要求製片，相差顯微鏡下觀察。

精子活力首先評估前向運動精子，然後是非前向運動精子和不活動精子，重複計數後核查兩值差異可否接受。

精子計數採用血球計數板，按要求進行稀釋並評估計數池內的精子數目，如兩次結果超出95%可信區間，需重新分析兩次。

雖然手工顯微鏡檢查已不能滿足臨床的發展需要，但精液分析SOP仍然是保障結果的重要基礎。

5．精子形態分析：嚴格精子形態分析能較好地預測受精能力和自發性受孕情況。

精子形態的評估是實驗室的技術挑戰，同一實驗室不同技術人員檢測結果差異較大，不同實驗室間檢測結果無可比性，是目前現狀。

由於各個實驗室檢測方法不一致、染色方法不統一、人員操作不規範、判讀標準不嚴格導致了檢測結果出現較大的差異。

雖然第5版手冊對各種形態異常精子給予分類、定義和圖示以供參考，但技術人員僅通過圖片及文字描述來嚴格定義正常或異常精子有實際的困難。

由於精子形態評估涉及因素較多，主觀性強，無量化標準，除了顯而易見的畸形外，真正能嚴格分清正常形態和臨界形態精子並不容易。

本次培訓先以幻燈片方式進行交流和討論，隨後在多人共攬顯微鏡下由老師進行悉心講解，讓大家對精子形態的判讀標準有了更深入理解。

存在判讀差異是非常正常的，必定每個人都有其獨特的審美標準，你覺得它長得很美，但別人未必那麼認為，觀點統一是不可能的。

所以，手冊上的形態彩圖僅由一位專家Dr Thinus Kruger進行分析，以確保異常精子標誌的一致性。

三、開展外部質控

精液標準化操作的普及、質控品的製備及缺少質量監管仍然是當下丞待解決的問題。

由於精液質控品的特殊性，本次外部質控只能進行精子濃度、形態及存活率的檢測，精子活力的評估並未納入其中。

按照WHO的標準推動外部質控的建立是好的開始，萬事開頭難，路並非平坦，總結經驗教訓，並逐步改進和完善是促進質量控制發展的重要途徑。

參加學習、培訓的目的就是豐富知識，強化標準，做好室內質控。

如果基礎設施不達標，內功修煉不到位，一切質控、質評都是空談。

四、思考

1．均衡發展：精液分析在檢驗科是一個弱項，一直未被臨床檢驗中心所重視，可以說處在一個非常尷尬的地位。

關於精液分析，生殖中心、男科實驗室、檢驗科臨檢室以及精子庫都在做，但操作者絕大部分來自檢驗人員。

本次培訓人員來自生殖中心/男科實驗室占65%、精子庫占21．7%、檢驗科占13．3%，看的部門多了，問題也就來了，誰來監管、誰來干預、誰來考核就成問題了。

精液分析在檢驗科不容忽視，更不能被遺忘，目前大多數的精液分析報告還是由檢驗科來完成的。

精液標準化和質量控制的推動，達到均衡發展，臨床檢驗中心的參與是有必要的。

2．染色液的選擇：不同的染色液會對精子頭的長軸、短軸、面積和周長產生影響，並出現不同的精子形態結果。

除了巴氏染色法，其它染色法並未建立相對應的參考標準。

巴氏染色法雖能有效提升精子頭部空泡的辨識率，但現場調查顯示，應用此染色方法的機構卻寥寥無幾， 而Diff-Quik染色卻占主流。

由於巴氏染色法操作步驟較多，耗時較長，這可能是實驗室應用受限的重要原因。

繼續推廣巴氏染色，還是建立多種染色法的對應標準，值得進一步探索和思考。

3． 計算機輔助精子形態學分析：計算機輔助精子形態學分析較人工操作具有更好的客觀性，高效性，精確性及可重複性。

計算機技術與圖像處理技術相結合，對捕捉到的圖像進行多參數的測量和計算，根據內置的標準得出客觀判斷。

只有頭部、中段、尾部都正常才能判斷為正常精子，計算機雖可準確識別精子頭部和中段缺陷，但對於尾部缺陷以及精子頭部的空泡（位置、數量、大小）仍需要人工添加判別。

計算機能有效區分用肉眼在顯微鏡下觀察不到的細微差異，從而導致了精子畸形率普遍偏高的現象。

計算機內置的形態數據多為巴氏染色，增加其它染色方法數據並作為可選是否可行。

通過人工校正後的精子下次出現類似形態後，能否加以記憶並自動給予識別。

4．關於第5版：關於第5版，爭議最大的就是形態。

精子形態分類由1980年第1版到2010年第5版經歷了自由方法和嚴格方法評估標準的演變。

4、5版都屬於嚴格標準，並不是說5版更嚴了，而是4版的時候就沒有認真對待，要論嚴格程度，4版其實是最嚴的。

所以，參考值的變化不應該成為影響我們對形態學評估的主觀因素。

4%的正常值能否對男性生育能力做出強有力的預測，以至於能否用該標準來衡量可育與不育人群產生了疑問。

專業共識的達成往往需要在分歧，乃至爭議得進程中逐漸取得平衡與完善。

實施嚴格得標準化操作和質量控制是精子形態學發展的必然趨勢，任何單一的精子質量參數都無法完全反應其生育能力，高畸形率精子往往伴隨其功能的下降，結合精子凋亡率、多重精子缺陷指數、精子功能學等多指標進行綜合分析更有意義。

5．兩次可信區間內：目前，精液自動化分析克服了檢測者主觀因素的影響，重複性強，在快速檢測精子活力、濃度的同時，還能顯示精子的運動軌跡，提供動力學的量化數據。

按照WHO的要求，精子濃度、活力和形態均需分析兩次，且兩次結果要在95%可信區間內，取均值報告。

也就是說一份報告至少要分析2次，甚至4次、6次，工作效率大打折扣，這在現實情況下難以做到，其實每個樣本能嚴格按照要求分析一次就不錯了，提升工作效率的同時也就意味著犧牲了質量。

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