人類精子發生過程中的基因表達調控網絡與細胞命運轉變路徑

Cell Stem Cell丨趙小陽/喬傑/湯富酬合作組報導人類精子發生過程中的基因表達調控網絡與細胞命運轉變路徑

人類精子發生過程承載著將父源基因組遺傳信息進行精準代際傳遞的任務，也是人類自身繁育和物種延續的重要保障。

全世界約有10-15%的育齡夫婦存在不孕不育的問題，其中，男性因素約占50%左右。

闡明人類精子發生過程中的基因表達調控機制是發育生物學的重大科學問題，對理解、診斷和治療男性不育相關疾病至關重要。

8月30日，南方醫科大學趙小陽課題組、北京大學BIOPIC中心湯富酬課題組以及北京大學第三醫院喬傑課題組合作，聯合在Cell Stem Cell上在線發表了題為Single-Cell RNA Sequencing Analysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis的研究論文。

首次從單細胞水平系統闡明了人類精子發生過程中的基因表達調控網絡和細胞命運轉變路徑，繪製了人類精子發生的高精度單細胞轉錄組圖譜，解析了成年男性全部生殖細胞類型及其關鍵的分子標記，並初步探索了將單細胞轉錄組技術用於人類非梗阻性無精症的研究和診斷。

這是該研究團隊繼2017年在Cell Stem Cell上發表論文揭示人類胎兒期生殖細胞基因表達特徵後【1】，在人類生殖發育領域裡取得的又一重要進展。

該研究團隊首先分離並獲取了正常成年男性和梗阻性無精症患者的2,854個睪丸細胞，對其進行了高精度的單細胞轉錄組測序分析，並結合t-SNE、PCA和Monocle2【2】等多種生物信息學分析方法對這些數據進行深度挖掘，在國際上首次完成了人類精子發生過程中的細胞命運轉變和基因表達圖譜的繪製。

在此基礎上，研究團隊進一步對一例非梗阻性無精症患者的174個睪丸細胞進行研究，確定了該無精症患者睪丸中的各種細胞類型及其與正常人睪丸中對應的細胞類型相比發生的基因表達異常，為男性不育的臨床診斷提供了新的思路。

該項研究主要有以下幾方面的重要成果：

1.人類精子發生過程中的細胞命運轉變和基因表達動態

該研究選取臨床捐獻的成年男性睪丸組織為材料，通過隨機挑選或流式分選兩種策略獲取睪丸組織的單細胞樣品，隨後進行高精度單細胞轉錄組測序，並藉助計算生物學方法對單細胞轉錄組數據進行深度挖掘（圖1a）。

經過非監督聚類分析，發現在2,854個睪丸細胞中共存在17種不同的細胞類型，其中14種為各個分化階段的睪丸生殖細胞，另外3種為睪丸微環境體細胞（圖1b）。

利用眾多特異的標誌基因對所有細胞類型進行身份鑑定，最終確定出3種精原細胞，包括精原幹細胞（SSC）、分化中的精原細胞（Diff.ing SPG）、分化後的精原細胞（Diff. ed SPG）；7種精母細胞，包括3種細線期精母細胞（L1~L3）、偶線期精母細胞（Z）、粗線期精母細胞（P）、雙線期精母細胞（D）、分裂期初級精母細胞及次級精母細胞（SPC7）；以及4種精子細胞（S1~S4）（圖1c）。

通過Monocle2對人類精子發生過程進行擬時間發育分析，發現由以上14種生殖細胞構成的發育路徑與經典的生精上皮發育過程高度吻合（圖1d）。

至此，該研究藉助高精度單細胞轉錄組測序技術完整地描繪了人類精子發生過程中細胞命運轉變的精確過程和基因表達變化的動態圖譜，為進一步深度解析人類精子的發生過程奠定了重要的研究基礎。

圖1：（a）項目的研究流程示意圖；（b）17類睪丸細胞轉錄組的t-SNE分析圖；（c）人類生精過程中標誌基因的動態表達變化圖；（d）人類睪丸生殖細胞的擬時間發育圖

2.確定人類睪丸生殖細胞各發育階段特異表達的新基因

基於t-SNE分析，該研究共發現了14種人類睪丸生殖細胞。

通過進一步分析，研究者找到了人類睪丸生殖細胞各發育階段特異表達的基因（圖2a），根據這些基因的表達模式能夠將特定階段的細胞類型與其他階段進行區分。

通過RNA原位雜交和免疫螢光染色實驗，研究者進一步確認，HMGA1在曲線精管基底膜的精原細胞中處於活躍的轉錄狀態（圖2b），SCML1主要在DMC1+的細線期精母細胞中高表達（圖2c），CCDC112主要在粗線期精母細胞中高表達（圖2d），而TEX29主要在早期精子細胞中處於活躍的轉錄狀態（圖2e）。

這些各發育階段特異表達的新基因的發現，為將來鑑定或分選特定階段的人類睪丸生殖細胞提供了重要的依據和線索。

圖2：（a）人類睪丸生殖細胞各發育階段特異基因的表達趨勢圖；（b）睪丸組織HMGA1的RNA原位雜交與DDX4的免疫螢光染色定位；（c）睪丸組織SCML1與DMC1的免疫螢光染色定位；（d）CCDC112與γH2AX的免疫螢光染色定位；（e）睪丸組織TEX29的RNA原位雜交與DDX4、PNA的免疫螢光染色定位

3.人類睪丸細胞的單細胞轉錄組資料庫為非梗阻性無精症的分子診斷提供了重要的參照標準

人類睪丸的單細胞轉錄組圖譜的繪製，使研究者對非梗阻性無精症的深入研究成為可能。

通過對一例非梗阻性無精症患者的174個睪丸細胞的單細胞轉錄組分析，發現這些細胞主要聚類到睪丸體細胞類型中的支持細胞和MIX細胞（圖3a）。

對該例非梗阻性無精症患者的體細胞差異表達基因進行分析，發現了包括BEX1、FATE1在內的一系列可能與該疾病發生相關的差異基因（圖3b，3c）。

利用Gene Ontology（GO）對差異基因進行分析後發現，非梗阻性無精症患者的體細胞中高度富集細胞凋亡、氧化應激等生物學過程（圖3d）。

隨後，免疫螢光染色結果證實了該例非梗阻性無精症患者睪丸組織中細胞凋亡表征明顯。

通過對該例無精症的探索，建立了基於單細胞轉錄組分析的無精症分子診斷平台，為研究不育症致病機制和臨床診斷提供了新的思路。

圖3：（a）生精上皮完整男性的2,854個睪丸細胞及NOA患者的174個睪丸細胞組成的t-SNE圖；（b）NOA患者與生精上皮完整男性支持細胞的差異基因火山圖；（c）NOA患者與生精上皮完整男性MIX細胞的差異基因火山圖；（d）NOA患者的睪丸體細胞上調基因中富集的生物學過程

綜上，該研究在國際上首次成功繪製了人類精子發生的高精度單細胞轉錄組圖譜，為人類精子發生、減數分裂調控機制的研究、無精症的分子診斷和臨床治療提供了全新的視角。

南方醫科大學汪妹博士，北京大學博士生柳溪溪、陳依東，深圳大學常港博士，廣州醫科大學附屬第三醫院安庚博士為該論文的並列第一作者，北京大學喬傑教授，湯富酬教授和南方醫科大學趙小陽教授為該論文的共同通訊作者。

參考文獻

1. Li, L. et al. Single-Cell RNA-Seq Analysis Maps Development of Human Germline Cells and Gonadal Niche Interactions. Cell Stem Cell 20, 858-873 e854 (2017).

2. Trapnell, C. et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nat Biotechnol 32, 381-386 (2014).

文章轉自：BioArt

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編輯：木森的夏天

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