遺傳性消化道腫瘤現狀及二代測序應用前景(下)

韋青 王晰程 沈琳

(原文發表於《中國醫學前沿雜誌(電子版)》)

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遺傳性非息肉病性結直腸癌

在遺傳性結直腸癌中根據有無息肉可大致分為兩類[3]。

第一類是以息肉病性為特徵，包括：家族性腺瘤性息肉病(Familial adenomatous polyposis)，Peutz-Jeghers綜合徵，幼年息肉綜合徵，Cowen綜合徵等。

這類遺傳病根據息肉不同的病理類型有不同的臨床表現和診斷標準，由於整體上發病率極低，故不再這裡進行詳細討論。

而第二類主要是遺傳性非息肉病性結直腸癌(Hereditary nonpolyposis colorectal cancer HNPCC)。

2.1

臨床和病理特徵

臨床上，HNPCC的診斷是根據阿姆斯特丹標準II來判定，標準包括：親屬中3例以上患有組織學證實的HNPCC相關腫瘤(包括結直腸癌、子宮內膜癌、小腸癌、腎盂輸尿管癌);其中1例為另外2例的一級親屬：腫瘤累及連續的二代人;其中至少1例發病年齡小於50歲;應排除家族性腺瘤性息肉病。

既往從概念上認為HNPCC和林奇綜合徵是可以互為替換。

但是隨著近10年的對於HNPCC的深入研究，發現符合HNPCC診斷的人群可細分為三類。

1、林奇綜合徵：指DNA錯配修復蛋白(Mismatch repair MMR)胚系突變的攜帶者，其遺傳方式為常染色體顯性遺傳。

這個人群不但結直腸癌的發病率高，子宮內膜癌、卵巢癌、泌尿系統腫瘤、其他消化道腫瘤的發病率都明顯上升。

2、類林奇綜合徵結直腸癌：這個人群雖然腫瘤組織的表型為高度的微衛星不穩定(Microsatellite instability MSI)，但是對錯配修復基因檢測均沒有發現存在胚系突變。

3、家族性結直腸癌X型：對於那些臨床上符合阿姆斯特丹標準，但其腫瘤組織呈微衛星穩定(Microsatellite stability MSS)人群均歸為此類。

最初的研究提示微衛星高度不穩定(H-MSI)通常位於近端結腸，分化差或伴有粘液腺成分並腫瘤周圍可見淋巴細胞浸潤[27]。

2004年美國國家癌症中心(NCI)發表了百慕達指南修訂版[28]，推薦符合以下標準的結直腸癌患者應該進行MSI的檢測。

其標準包括：1)患者診斷時年齡<50歲;2)年齡不設限，存在同時或異時性結直腸癌，或者其他林奇綜合徵相關的腫瘤;3)患者診斷時年齡<60歲並且具有MSI-H的組織學特徵：4)結直腸癌患者有1個或1個以上一級親屬診斷有林奇綜合徵相關的腫瘤，其中一個診斷年齡小於50歲 5)年齡不設限，結直腸癌患者有2個或以上的一級或者二級親屬患有林奇綜合徵相關的腫瘤。

2.2

分子病因學

在HNPCC人群，目前病因最明確的就是林奇綜合徵，它是由一組錯配修復基因(MMR)之一出現缺陷造成的。

這組基因包括：MLH1，MSH2(包含因EPCAM缺失所致MSH2過度甲基化)，MSH6和PMS2，其主要功能就是幫助修復DNA聚合酶在DNA複製過程中產生的核苷酸配對錯誤。

因此如果MMR當中任何一個基因出現缺陷時，就會導致MSI，從而導致細胞每次分裂時的基因組DNA的自發突變率明顯提高。

而一旦新發突變位導致某些抑癌基因失活，或者原癌基因過度活化就會惡變。

針對MSI的檢測方法包括對MLH1，MSH2，MSH6和PMS2基因進行免疫組化染色或對基因組微衛星狀態的PCR方案檢測。

兩種方法一致性較高，約90-95%。

2.3

基因篩查、隨訪和治療

NCI的百慕達標準修訂版制定了結直腸癌人群進行MSI篩查的標準。

但是隨著對林奇綜合徵和錯配修復基因的深入研究，無論是阿姆斯特丹標準II還是百慕達修訂指南均存在遺漏篩查人群的可能，因此美國胃腸病學會於2015頒布的最新指南推薦對於所有初診結直腸癌均應進行微衛星狀態的檢測。

由於約95%林奇綜合徵和10-15%散發的結直腸癌其腫瘤組織均呈MSI狀態。

因此對於初篩為MSI的人群，還應進行胚系錯配修復基因的檢測予以明確診斷是否為林奇綜合徵。

此外，對於MHL1免疫組化表達陰性的結直腸癌，可先進行BRAF基因和/或MHL1啟動子甲基化的檢測。

如BRAF基因突變或MHL1過度甲基化，提示其MSI表型是由於體系突變所致。

一旦被明確診斷為胚系錯配修復基因突變(林奇綜合徵)的攜帶者，應進行嚴密的隨訪計劃[3]。

這包括：自20-25歲起每年或每兩年一次的結腸鏡檢查;自30-35歲起每年的經陰道超聲和子宮內膜活檢;生育過的女性可考慮行預防性的子宮及雙側附件切除術;自30-35歲每3-5年進行一次胃鏡檢查，同時應進行幽門螺桿菌的根除治療。

在腸鏡篩查中如結腸發現惡性病變，應考慮行全結腸或全結直腸切除術。

Parry等回顧性研究發現在332例MMR突變的標準根治術後的結腸癌患者中，有22%(74例)出現異時性大腸癌;而行擴大切除的50例結腸癌患者均未出現異時性大腸癌。

但是對於攜帶錯配修復基因突變的直腸癌患者，是否行全結直腸切除術是個複雜的臨床問題。

儘管直腸癌的MMR突變攜帶者接受標準直腸癌根治術後，仍有較高的幾率(27%)出現異時性大腸癌。

但是如果進行全結直腸切除+迴腸造口術，患者圍手術期風險和生活質量都會受到嚴重影響。

因此是進行更激進的手術切除還是選擇直腸切除加更加密集的腸鏡監測尚無定論。

由於錯配修復缺陷的檢測涉及到多個基因，因此無論是MSI的初篩還是胚系突變的遺傳檢測都應在有相關資質的實驗室進行。

並且對於攜帶者的隨訪涉及到多個器官，故和遺傳性瀰漫型胃癌一樣，HNPCC診斷、監測和治療也應該是在多學科團隊協作指導下全程管理。

3

二代測序技術在遺傳性消化道腫瘤的應用

對於無論是遺傳性胃癌還是遺傳性非息肉病性結直腸癌，都存在一個共性的問題：約有一半甚至更多符合臨床診斷的病人或家系無法找到明確的分子致病機制。

出現這樣的問題有以下幾個可能：1、臨床診斷符合某類遺傳病綜合徵，儘管對目標基因進行檢測未發現突變，但不能除外是否患者是否攜帶尚未發現的致病性突變。

2、臨床上符合某類遺傳病(綜合徵)的診斷，但是其致病因素是由於未知基因所導致。

3、由於臨床表現多樣和腫瘤家族史不典型，其臨床診斷的遺傳綜合徵與其遺傳致病基因不符。

既往研究就曾發現遺傳瀰漫型胃癌家系曾被誤診為遺傳性乳腺癌。

目前，二代測序技術應用廣泛，這項技術可同時進行上百萬個DNA片段的測序，因此測序時間和測序成本都大大減少，這些優勢為解決上述問題提供了可能。

所以近些年二代測序技術在遺傳病應用的重要性也逐漸突兀，尤其是全外顯子測序或者是針對多個遺傳相關基因譜的測序為遺傳性消化系統腫瘤的診斷和研究提供了大量信息。

最近的研究顯示對於具有遺傳性腫瘤家系進行二代測序,均能發現傳統檢測方法沒有發現和/或既往尚未報導的新致病性突變。

同時,在具有消化道腫瘤遺傳性高危家系中，利用二代測序對多個相關遺傳基因檢測，可發現部分高危家系存在致病性的遺傳基因突變。

而這些突變如果僅根據現有的臨床標準是無法診斷的。

此外，一些新的與遺傳性結直腸相關的基因也通過二代測序被發現。

Palles等人通過全基因組測序發現POLE和POLD1兩個基因和遺傳性腺瘤病和遺傳性結直腸癌均有比較明顯相關性。

但是既往研究卻把部分攜帶POLE或POLD1突變的患者劃歸到與錯配修復缺陷相關的HNPCC人群中。

但是與一代測序相比，對於序列已知的單基因的突變檢測，工作量仍較大，費用也偏高。

另外，二代測序技術依賴於基因樣品的反覆擴增，容易出現錯誤累積;大量的數據拼接工作和光學讀取產生的龐大數據，對信息存儲和計算的要求很高。

此外，還需要專業的生物信息人才過濾、篩選，也帶來額外的人力、物力和時間消耗。

最重要的是，檢測出的大量遺傳信息有很高的比率存在不能確定是否為有意義的變異(variants of uncertain significance，VUS)，如何正確的解讀這些數據，都需要多專業的交叉合作。

另外, 某些檢測到的基因，只有少量數據支持其存在遺傳風險或者相關腫瘤風險很低，那麼接受遺傳諮詢的家庭成員只能依靠腫瘤家族史進行隨訪，而不能完全依賴基因分析結果預測風險。

4

我國遺傳性消化道腫瘤現狀和展望

在我國青年胃癌中，病理類型為瀰漫型腺癌伴/或印戒細胞癌並不少見，但關於遺傳性瀰漫型胃癌的研究十分匱乏。

多為個例報導且這些案例是否與CHD1胚系突變相關尚需檢驗。

這可能與我國臨床醫生對這類遺傳性胃癌認識程度不夠有關，同時可進行CDH1基因的突變檢測中心也非常少，也限制了遺傳性瀰漫型胃癌基因篩查工作的開展。

相比之下，我國針對遺傳性非息肉病性結直腸癌的診斷和研究工作就顯著增多。

在早期的研究中提示，在符合阿姆斯特丹診斷的中國家系中胃癌的發病率較歐美國家明顯提高，而子宮內膜癌的發病率卻相對較低。

但遺憾的是其分子機制方面研究僅集中在MHL1和MSH2兩個錯配修復基因上，尚缺乏系統性對MMR相關基因的深入研究，故能確診為林奇綜合徵的患者比例明顯偏低，更無規範來指導這類患者和攜帶者如何進行有效的隨訪和監測。

另一方面，一些社會經濟和生活習俗等因素也制約著我國開展消化系統腫瘤的篩查工作。

在經濟欠發達或偏遠地區，收集腫瘤患者完整病史和標本相對比較困難。

由於國內人口政策的長期推廣，獨生子女小家庭的增多導致許多具有遺傳背景的家系因不符合相應的診斷標準而錯失篩查。

此外，隨著人口流動性大增加，準確家族史的採集和家系成員的組織標本的收集也有很大難度。

還有不容忽視的一點就是當前我們更多的是依賴歐美國家推薦的指南來進行相關的基因篩查。

可是由於人種不同，生活環境、飲食習慣也與西方國家存在明顯差異，那麼這些差異是否會影響有明確遺傳背景的家系的甄別尚不得知。

綜上所述，對於我們這個人口大國而言，開展遺傳性消化道腫瘤的臨床診斷和科學研究還任重道遠。

除了提高廣大臨床醫生對遺傳性消化道腫瘤的認知以外，培養具有診斷、基因篩查和治療經驗的內外科醫師、內鏡醫師、病理科醫生、遺傳學家和生物信息學專家才是當前首要任務之一。

在此基礎上，胃腸腫瘤病源量大的腫瘤中心應建立遺傳性惡性腫瘤診治的多學科團隊。

並在多學科團隊的指導下完成家系和標本庫的建立、高通量的基因篩查以及相關家系的長期隨訪。