微流控技術在心肌標誌物檢測中的應用

自50年代以來，動態測定一些代謝酶活性，如乳酸脫氫酶和穀草轉氨酶等，一直是診斷AMI（Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死）的金標準。

但由於這些代謝酶在人體的其他器官和肌肉中也大量存在，除 AMI外，運動、炎症也可引起乳酸脫氫酶和穀草轉氨酶等的升高，所以對他們的檢測不具有提示患有AMI的特異性。

近幾年來，一些新的具有高度特異性和敏感性的心肌標誌物檢測指標被普遍用於臨床實驗室診斷，如心肌肌鈣蛋白T(cTnT)或心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、肌紅蛋白 (Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、B型尿鈉肽(BNP)和超敏C 反應蛋白(CRP)等。

正確應用這些新的心肌標誌物，為臨床準確診斷、鑑別診斷和判斷治療效果起到了革命性的作用。

微流控晶片技術作為近年來發展迅速，集生物、化學、醫學、流體、電子、材料和機械等於一體的嶄新研究領域，具有液體流動可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度快和高通量測試等特點，可以在幾分鐘甚至更短的時間內進行上百個樣品的同時分析，並且可以在線實現樣品的預處理及分析全過程，是進行心肌標誌物檢測的理想平台。

微流控晶片光學方法檢測心肌標誌物

目前對於心肌標誌物的檢測，大多是基於抗原抗體的免疫反應。

生物學家通常利用螢光物質 標記抗原或抗體或酶標抗體，然後從反應生成物的螢光強度、反應底物比色和捕獲化學發光底物微光來定量被檢測物的濃度。

底物可見光比色法因靈敏度相對較低，一般無法滿足低濃度心肌標誌物的檢測需求，應用較少。

而螢光免疫方法因具高靈敏度而被多數研究者採納。

對於微流控晶片微米級的檢測通道，螢光免疫方法有時並不能滿足低濃度心肌標誌物的檢測要求。

為此，有團隊創造性地設計了濃縮螢光標記物的反應池和嵌入式光電倍增管檢測裝置，實現了對C反應蛋白（C-Reactive Protein，CRP）的低濃度檢測。

其具體實驗過程如下：首先製作了帶1mm×0.8mm×30um預濃縮反應池的T型聚二甲基矽氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)晶片，在反應池中設計物理微結構富集CRP抗體包被的磁珠；然後將螢光標記的CRP抗原和待檢測CRP抗原注入反應池，孵育後洗脫螢光標記；最後在反應池下游微通道利用嵌入式光電倍增管檢測螢光信號，結果測得CRP最低檢測限為1.4 nmol/L。

該方法有效地提高了檢測的靈敏度，但缺點在於磁珠修飾抗體和螢光標記抗原等操作都必須在晶片外進行，檢測時間相對較長。

利用微流控晶片平台分析生物標誌物時，常需各種進樣泵和驅動泵等，使平台極其複雜。

有團隊利用空氣在PDMS中溶解度高和擴散速度快的特性，研製了無動力注射的免疫分析晶片。

該晶片具有結構簡單、使用方便等優點。

在實驗過程中，他們對競爭法和夾心法非均相免疫分析都進行了研究，操作如下：通過先將抗體修飾於內壁，再利用螢光法檢測兔IgG和人CRP。

最終結果顯示：樣品消耗為1μL，免疫分析時間為 20 min，檢測限分別為 0.21 nmol/L和0.42 nmol/L。

以上表明該方法具有樣本消耗少、分析時間短和檢測靈敏度較高等優勢。

微球免疫分析通常能增大抗原抗體的結合面積，縮短抗原抗體所需要的反應時間，提高檢測 靈敏度。

有團隊在矽片上加工出微室陣列，將共價鍵合抗體的瓊脂凝膠微珠裝入微室中，通過毛細管引入各種反應試劑，然後利用螢光或可見光比色檢測唾液中 CRP，最終 12 min 完成檢測，最低檢測限達5 fg/mL，而在10 fg/mL～10 pg/mL間有較好的線性相關性，檢測靈敏度優於商品化超敏CRP ELISA檢測試劑盒。

這種微球分析與微流控結構相結合的系統，靈活減小了分析設備體積，實現了唾液中微量CRP的超靈敏檢測。

晶片表面的親疏水性直接影響晶片的檢測效果。

表面改性一直是微流控晶片的重點研究領域。

國外團隊對環烯共聚物(Cycloolefin Copolymer，COP)晶片表面性質進行改性：分別用氧等離子體氧化、3-氨丙基三乙氧基矽烷 (APTES)矽烷化和右旋糖酐修飾來增加其表面親水性，進而易於捕獲抗體結合。

該改性手段穩定可靠，結合免疫檢測方法，實現了對血液中CRP的低濃度檢測，最低檢測限達 2.6 ng/mL。

利用微流控晶片平台高通量分析心肌及其他生物標誌物，可以節約檢測成本和時間，是未來的發展趨勢。

國外研究機構結合非競爭免疫分析、裂解標記免疫分析(Cleavable Tag Immunoassay， CTI)和膠束電動色譜(Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC)，同時分析了AMI的CK-MB、cTnT、cTnI和Myo四種心肌標誌物。

通過對以上四種心肌標誌物抗體進行不同螢光物質標記，使反應後被切割的螢光標籤在芯 片MEKC中層析分離，而每種螢光標記在晶片MEKC 中有不同的遷移率，通過定量不同螢光 標籤量來定量各組分標誌物濃度。

利用該平台對CK-MB、cTnT、cTnI和Myo的檢測限分別為 3 ng/mL、25 pg/mL、2 ng/mL和5 ng/mL。

該研究的局限在於CTI 和 MECK分開進行，未能整合在一塊晶片上實現。

故該研究組還在研究晶片在線CTI，將晶片在線CTI與晶片MEKC結合，真正實現微流控晶片的高通量分析，促進即時診斷產業的發展。

微流控晶片電化學方法檢測心肌

與光學檢測方法相比，電化學方法具有靈敏度高、反應快、電極微型化、對晶片材質沒有特殊要求等特點。

電化學方法已慢慢成為當今微流控平台的主要檢測手段。

隨著微電極加工技術的發展，研究者經常採用一些特殊技術結合電化學檢測方法來達到痕量 檢測。

如利用自組裝單層膜技術結合電化學檢測方法，檢測Myo和血紅蛋白。

該研究中工作電極是1 cm×2 cm的金修飾矽片，其表面修飾有自組裝單層膜，當待測樣本結合到膜上時，工作電極與參比電極間電位發生改變，通過檢測電勢變化而測定樣本中蛋白濃度。

將此技術與微流控晶片相結合，減少待測樣本體積和檢測時間，增加反應靈敏度，是理想的即時診斷平台。

利用量子點標記抗體結合方波溶出伏安法(Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry)同時檢測兩種心肌標誌物cTnI和CRP。

通過SWASV與微流控平台結合，利用微通道電泳濃縮並輸送金屬離子。

當cTnI和CRP分別在0.01～50μg/L和0.5～200μg/L範圍內時，檢測電流與檢測物濃度具有較好的線性一致性。

該方法檢測cTnI和CRP的最低檢測限分別為0.004μg/L 和0.22μg/L。

通過極譜電流時間曲線法監測電子轉移，實現了對 cTnT 的超靈敏檢測。

作者加工了具有多個電極的COP微流控晶片，該晶片含一個捕獲磁珠帶、兩個參比電極和一個工作電極，可同時獨立檢測六個樣本。

作者用該系統檢測了溶解在PBS中的cTnT和真實血樣中的cTnT 含量，最低檢測限分別達0.017 ng/mL 和0.02 ng/mL，靈敏度大大超過傳統手段。

另外，離心微流控磁碟因其自動化、可一次性使用、不用注射泵、沒有複雜的流體相互聯繫、僅靠離心力驅動樣本等特點，在微流控晶片領域廣受歡迎。

其他微流控晶片檢測心肌標誌物

隨著傳感器技術的迅速發展，越來越多的檢測手段被用在對心肌標誌物的檢測。

如設計與玻片鍵合的T型PDMS晶片，同時在玻片上加工兩塊鍍金薄膜A和B。

樣本中的BNP通過 EDC/NHS系統先與薄膜A結合，之後加入乙醯膽鹼酯酶修飾的抗BNP抗體，然後再加入硫代乙醯膽鹼，硫代乙醯膽鹼在乙醯膽酯酶的催化下變成硫代膽鹼併流動至薄膜B上聚集。

而薄膜B處有表面等離子體共振(SPR)檢測裝置，硫代膽鹼在薄膜B處的聚集可引起SPR角度改變。

之後根據硫代膽鹼的濃度與上游加入薄膜A上的BNP 濃度成反比，進而可通過SPR 角度改變來測定BNP濃度。

結果表明該系統檢測BNP時，在5 pg/mL～100 ng/ml具有較好的靈敏度，檢測時間僅為 30 min。

有團隊採用光子晶體內全反射系統(PC- TIR)，設計一個獨特的敞開光學微腔，以便功能化微腔表面，使抗原抗體更好地結合。

作者用四氫呋喃、APTES、羧甲基右旋糖酐等處理傳感器 表面並固定Myo 抗體在其上，利用PDMS加工的微通道輸送待測樣本和對照液體PBS到傳感器部位。

當待測樣本中目標抗原Myo與傳感器表面抗體結合後，共振波長反射泡發生漂移，波長的偏移值與待檢測的Myo濃度成正比。

該法檢測限達70 ng/mL，在70～1000 ng/mL 範圍內有較好的線性一致性。

光學法檢測心肌標誌物主要包括螢光和化學發光兩種方法。

螢光法需要外加光源激發分子產 生能級躍遷，進而發光。

由於生物樣品中的蛋白質、胺基酸等分子也會產生背景螢光，故需選擇合適的螢光試劑和樣品處理方法，減少非特異性吸附蛋白的影響，降低背景干擾。

而化學發光是自身發光，無需外加光源，背景干擾小，靈敏度更高，但需暗室及進行冷發光檢測，其檢測器體積相對較大。

電化學分析法可分為電導分析法、電位分析法、伏安法、極譜分析法、電解和庫侖分析法等。

這些方法分析靈敏度和準確度較高、測量範圍寬、儀器設備簡單、價格低廉，運用於微流控晶片檢測平台時，對晶片材質沒有特殊要求，並可以將電極微型化以減小平台體積。

與光學法相比，電化學法在心肌標誌物檢測方面具有更廣闊的應用前景。

微流控晶片作為一門新興學科，可以集進樣、預處理、分離和檢測於一體，具有樣品需求量小、便攜、分析快速等特點，是理想的心肌標誌物檢測平台。

研究和發展適應於心肌標誌物即時診斷的微流控晶片產品，符合檢驗醫學自動化和簡單化的發展趨勢，適應當今社會高效、快節奏的工作方式，滿足心血管疾病患者在時間上快速檢測的要求，可使患者儘早得到診斷治療。