酵素活性分析

(2) 酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)的量。

受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳 ... 酵素活性分析       一、Beer’s law 二、抽出液中含有的酵素活性單位 三、酵素-催化反應的反應速率單位 四、酵素活性問題及解答               一、Beer’s law 若某一化學物質可吸收某一波長的光 (如H2O2可吸收波長240 nm的光)，則該化學物質在溶液中的濃度，會與溶液對該波長的吸光值(absorbance)成一正比關係，因此利用分光光度儀(spectrophotometer) 測定吸光值後，即可推知該化學物質在溶液中的濃度。

  化學物質在波長l的吸光值(Al; absorbance)定義為Al =log(I0/I)。

吸光值另稱為optical density(OD)。

吸光值(或OD值) 只為一個數值，並無單位。

I0(incidentlightdensity): 為分光光度儀所放出波長l的光束強度。

I (transmittedlightintensity):為I0經過溶液及石英管後，所穿透出的光束強度                  化學物質在波長l的吸光值(Al)與下列兩項因子成一正比關係:   (1) 化學物質在溶液中的濃度 (C;單位: M或mg/ml 等)。

(2) 所用石英管(cuvette)的寬度(l; 單位:cm )。

  此正比關係稱為Beer’s law(或Beer-Lambert law):即Al = el Cl   el:為一比例常數(proportionality constant)，稱為該化學物質在波長l的extinction coefficient，單位為 mM-1cm-1或liter mol-1cm-1等。

el 可經由實驗求得，即先配製不同濃度的化學物質，在波長l及固定寬度的石英管中，測定吸光值，即可依實驗所得的數據，求得el。

例如，H2O2在波長240 nm的el =0.0395mM-1cm-1。

  二、抽出液中含有的酵素活性單位: 抽出液中含有多種蛋白質，這些蛋白質中，有些則具有某些酵素活性。

例如，種子抽出液中，含有多種酵素，其中有一種即為a-amylase。

抽出液中，某一種酵素含有多少量，通常以實際的酵素活性表示，常用的單位有兩種:    (a)以units/ml表示，即1 ml的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。

 (b)以unit/mg表示，即抽出液中，每1 mg的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活性，此表示方法，稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。

對某一酵素而言，抽出液的比活性愈高，則抽出液含有該酵素的純度愈高。

  (2)酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)的量。

受質減少(或產物增加)的量，可視實驗的需求或方便性，以莫耳(mole)、克(g)、OD吸光值等表示。

例如: 1unit可表示在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1mmole;亦可表示為在一分鐘內，可使受質減少(或產物增加) 1mg;或可表示為在一分鐘內，可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)。

  例如: O.D.值變化量   活性 = (樣品蛋白質含量) X(反應時間-分鐘)    三、酵素-催化反應的反應速率單位: 酵素反應的速率，以最初反應速率(initial velocity)表示，單位為mmoles/min，亦可以mmoles/liter-min表示。

  在適當條件[適當溫度、pH 值、及離子強度(ionic strength)等]，且酵素的受質量很足够 (即最初的受質濃度大於酵素濃度時)的情況下，加入一定量的酵素溶液，則在不同時間後，受質的減少量(或產物的增加量)呈現如下列的圖形中的曲線。

在曲線上的每一點的切線(如圖中的1, 2,3)的斜率，為在該時間的反應速率。

因此，在同一個最初的受質濃度，若取不同時間點，則會有不同的反應速率。

通常在特定的最初受質濃度下，酵素反應的速率，均以最初反應速率(initial velocity;即酵素反應開始進行時的速率)表示。

因此，在曲線上取的點，若越接近原點，則該點的切線的斜率，越接近最初反應速率，如下圖中，切線1的斜率可視為酵素在某一最初受質濃度之下的最初反應速率。

                     四、酵素活性問題及解答: 植物組織抽出液，經蛋白質定量後，抽出液含有20 mg/ml的蛋白質。

在反應體積為0.5 ml，內含10 ml抽出液，以測定抽出液中酵素A的活性。

在適當條件下[適當pH 值、離子強度(ionic strength)、所有受質為飽和濃度等]，酵素A一分鐘內，可催化產生3 mmoles 產物。

請計算:   (1)酵素-催化反應的最初反應速率(initial velocity)， (1-1)以mmoles/liter-min 表示。

(1-2)以mmoles/min 表示。

(1-3)如在標準反應體積1.0 ml下，取10 ml萃取液進行反應，則反應速率為多少 mmoles/liter-min。

  (2)抽出液中酵素活性(enzymatic activity): (2-1)抽出液的酵素A活性，以units/ml 表示， (2-2)抽出液的酵素A的比活性，以unit/mg protein表示。

  解答:   (1)    酵素-催化反應的最初反應速率:   (1-1)         以mmoles/liter-min 表示。

n =(3mmoles/min)/0.5 ml=(3mmoles/min)/0.5 ´10-3 liters =3/(0.5´10-3) mmoles/liters-min n =6´103 mmoles/liters-min   (1-2)        以mmoles/min 表示。

n =3mmoles/min   (1-3)         如在標準反應體積1.0 ml下，取10 ml萃取液進行反應，則反應速率為多少mmoles/liter-min。

n =(3mmoles/min)/1.0 ml=(3mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters =3/(1.0´10-3) mmoles/liters-min n =3´103 mmoles/liters-min   或可以下列方法計算: 因反應總體積加倍，造成酵素濃度減半，因此反應速率(mmoles/liter-min) 將減半。

所以   n =(3mmoles/min)/1.0 ml=(3mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters =(6´103 mmoles/liters-min)/2 n =3´103 mmoles/liters-min   當反應體積增加時，產物總量依然不變。

雖然mmoles/liter-min 的反應速率減半但反應總體加倍。

因所有的反應均在受質的飽和濃度下進行，每一反應的反應速率為Vmax 值。

  (2) 抽出液中酵素活性(enzymaticactivity): (2-1) 抽出液的酵素A活性，以units/ml 表示，   1unit 定義：在適當反應條件下，每分鐘催化產生1 mmoles 產物所需的酵素量。

因此，反應速率3 mmoles/min 相當於3 units。

以10 ml 萃取液產生3 units， 酵素A活性= 3units/10ml =3units/0.01ml 酵素A活性 =300units/ml   (2-2) 抽出液的酵素A的比活性，以unit/mg protein表示。

比活性(specific activity)定義：每毫克(mg) 蛋白質所含酵素units。

比活性=(300 units/ml)/(20mgprotein/ml) 比活性=15 units/mgprotein   含有catalase的蛋白質溶液中，含有蛋白質的濃度為 0.5mg/ml，取 200ml至H2O2溶液中，使最後測試溶液的總体積為1 ml，並以分光光度儀(spectrophotometer) 測定OD240。

一開始測的OD240 =0.1，經過一分鐘後，OD240 降至 0.054，請求出含有catalase的蛋白質溶液的catalase的比活性 (mmol/min/mg)。

(石英管的寛度為1 cm;H2O2在波長240 nm的el =0.0395mM-1cm-1)。

  註: 1.catalase 催化以H2O2為還原劑，將H2O2還原成H2O的反應: H2O2+H2O2-> O2+2H2O。

  2. 含有酵素的蛋白質溶液的比活性(specificactivity)，以unit/mg表示， 即溶液中，每1 mg的蛋白質含有多少酵素活性單位(unit)。

  3.酵素活性單位(unit)，指在單位時間(通常為分鐘)內，酵素使受質減少(或產物增加)的量， 單位可為 mol/min。

  解答:   1.以Beer’s law(Al =el Cl)計算一分鐘之內，測試溶液中受質(H2O2)的減少量: (1)一分鐘內OD減少值：0.1-0.054 =0.046 ∵Al =el Cl ∴0.046= 0.0395(mM-1cm-1)´C´1(cm) C=0.046/0.0395(mM-1)=1.165mM ∴一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mM   (2) 測試溶液總體積為1ml 1.165(mM) ´1 (ml)=[1.165´10-3 (M)]´[1´10-3 (L)] =1.165 ´10-6mole =1.165mmole ∴ 一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mmole ∴ 酵素活性單位(unit)= 1.165 mmole/min   2. 計算測試溶液中蛋白質的含量:   0.5 (mg/ml)´200 (ml)=0.5(mg/ml)´0.2 (ml)=0.1mg ∴ 溶液中含有蛋白質0.1 mg   3. 計算溶液的catalase的比活性: 比活性(unit/mg) =1.165(mmole/min)/0.1 (mg)=11.65mmole/min/mg