EPA Ana 6 活性

酵素活性的偵測，通常是固定在一段 時間(t) 內，觀察生成物的產量 (P)。

因此反應進行一定時間後需中止反應，再進行生成物的定量。

而P/t 即為此酵素的反應速率(v ... 　 　 　 酵素純化 Enzyme Analysis 6  酵素活性測定 EnzymeActivityAssay 基本：科學研究 - 酵素實驗室 - 酵素 純化：蛋白質抽取 - 層析法 -其他方法 -純化策略 分析：蛋白質定量 - 活性測定 -電泳法 -蛋白質科技 總目錄 ■ 上課網 ■ 下載區 ■ 　 　 　 參考資源 目錄 6.1  催化反應 設計原則  基質濃度  動力學基礎 6.2  酵素活性分析 測定方法 中止反應  連續測定 澱粉磷解酶 6.3  維持酵素活性 緩衝液  試劑保存 活性維持  活性單位 問題集  一種酵素(PCS)的活性區 下載[內文 pdf] [投影片pdf] [影音檔 6amp4] [影音檔 6bmp4]  Wikipedia   [Enzyme activity] {BCbasic} 連結生物化學基礎 　 　 　 　 6  酵素活性測定 參考資源 6.1  催化反應： a.反應設計原則： 大部分酵素反應方式，都可包括在圖6.1 的大綱中。

建立酵素活性測定步驟時，請注意以下原則︰ (1)測定生成物的產生量，比測基質(反應物) 的消失量，更方便且靈敏。

除非不得已，儘量避免測定反應物。

(2)反應流程儘量簡單，太複雜的操作過程，增加工作量及成本，且容易造成失誤。

(3)複雜的反應，可能產生某些意外的生成物(或pH 改變)，回饋抑制酵素反應(圖6.1中以負號表示)。

(4)反應條件必須有利於指定反應方向，可以移除生成物(以籃框表示) 或連上耦合反應。

(5)小心樣本中有無其他酵素(或抑制劑) 干擾，會因為消耗反應物或生成物，加強或減弱目標酵素的活性，造成假象而誤判。

(每張圖均連結有960x720清晰版本) b.反應基質及酵素濃度： 在試管中進行的酵素活性分析，與生物体內的酵素反應，有相當差距。

為使反應達最大活性(Vmax)，或往指定方向進行，所使用基質濃度為十倍 Km。

反應的最適pH、溫度、時間等條件，均需以實驗求得，尤其酵素的用量影響結果甚鉅，要事先找出最適當的使用濃度。

c. 不要忘了基本的酵素動力學： 本課程的主旨是在探討酵素的純化技術與分析方法，對於酵素的催化行為以及所衍生的基礎知識，並沒有討論很多。

但是，不要忘了後者才是研究酵素的最終目的，由簡單的動力學分析，就可以得知許多酵素與其基質間的作用關係，以及酵素催化的分子機制，請務必要体會這一點提醒，也要隨時回顧基本的酵素動力學。

▲ [Enzyme catalysis] 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 {Enzyme kinetics} 6.2  酵素活性分析： 酵素活性的偵測，通常是固定在一段 時間(t)內，觀察生成物的產量 (P)。

因此反應進行一定時間後需中止反應，再進行生成物的定量。

而P/t即為此酵素的反應速率(vo)，也就是酵素活性。

但若可以連續記錄反應過程，則有無中止反應並不重要。

6.2.1酵素活性測定方法： 反應一段時間(t)後中止反應，測生成物量(P)即得活性 (P/t)。

以下為各種測定生成物的方法，任何物理、化學甚或生物方法都可使用。

a.直接測定生成物： 所有去氫酶均可測定NAD+與NADH 間的變化量，即為去氫酶的活性。

例如酒精去氫酶催化下式之正反向反應： Ethanol＋NAD+→ Acetaldehyde＋NADH＋H+ 反應液中NADH在340nm波長有吸光變化(如圖6.2)。

b.耦合反應法： 若生成物(P)無法直接測得，設法把生成物再進行耦合反應，變成可測量的產物 (Q)。

很多酵素可耦合到上述去氫酶的反應，則可測340nm波長變化。

S→P→Q c.化學測定法： 若生成物具有化學活性，則可直接進行化學反應，例如蔗糖以 轉化酶(invertase,IT) 水解成果糖及葡萄糖，兩個單糖產物都是還原糖，可測定所生成還原糖之還原力。

d.放射線測定法： 若基質分子中含放射性核種，酵素反應後追蹤生成物的放射線量，即可知酵素活性。

麻煩的是，要分離開反應物及生成物，有時不太容易，可用HPLC、濾紙色析法 (PPC)或離子交換法等。

e.測壓法(manometry)： 若生成物為氣体，則可測定氣体体積之增加量。

尤其有氧氣生成時，可用 Warburg氏呼吸計測之。

f.電極︰ 有些電極可直接測定反應的變化，例如若有pH或氧濃度的改變，則可用pH 計或氧電極。

酵素電極把酵素固定在薄膜上進行反應，然後直接測定反應物的改變，相當方便，但多用在工業或醫療界有大量樣本時。

g.HPLC檢定法： 若產物無法以其他任何方便的方法檢測時，最終可用HPLC 來分析產物，但相當費時且需要較昂貴的設備。

6.2.2中止酵素反應方法： 注意任何中止反應的方法均不得破壞生成物，或干擾儀器測定。

(1)最常用急速加熱(100℃水浴)10min，注意有些蛋白質(如 RNase)仍然無恙。

(2)以3~5%TCA(三氯乙酸)改變 pH，使酵素變性沉澱，再離心去除沉澱取上清。

(3)用1%SDS中止反應，注意proteaseK等在SDS 下仍有活性。

(4)若該酵素需二價離子，則加入EDTA中止反應。

(5)若該酵素有專一性抑制劑，則可加入抑制劑。

(6)若使用放射性基質，可加入大量不具放射性(cold) 的基質，看來具有放射性的生成物不再產生了，但實際上酵素反應並沒有停止。

6.2.3連續測定法(continuous-reaction)： 連續測定法可不用刻意中止酵素反應，但通常要使用儀器即時監控生成物。

a.連續測定法： 若酵素反應，在其反應過程中可以一邊進行觀察，則可連續測定反應的情形，不須中止反應，上述 酒精去氫酶即可連續監視340nm 波長的變化。

若生成物無法直接觀測，也可連接某一耦合反應，把生成物轉變為容易觀察的物質。

b.連續的耦合反應： 耦合反應在連續測定法應用相當多，但由於耦合反應更複雜，甚至成為一個迷你的代謝途徑。

這種複雜的反應中有較多試劑與產物，許多不必要的副反應可能出現，干擾反應結果，因此要作好對照的控制組，以免有假結果出現。

6.2.4澱粉磷解酶活性分析： 以澱粉磷解酶(starch phosphorylase,SP;EC2.4.1.1) 為例，說明如何以生物化學方法偵測其活性，並提醒活性分析如何受其他物質干擾而造成假象。

a.澱粉磷解與合成： 注意磷解(加磷酸分解)不是水解(加水分解)，此反應為可逆(Pi 為無機磷)： (Glc)n-Glc+Pi→(Glc)n+Glc-1-P (磷解方向) (Glc)n+Glc-1-P→(Glc)n-Glc+Pi (合成方向) 合成方向反應可測無機磷(Pi)生成，而Pi 的檢定有方便的化學呈色反應。

反之，磷解方向應如何設計方便的活性分析方法？ b.延長澱粉鏈： 澱粉磷解酶以可溶性澱粉(Glc)n作為 引子(primer)，催化Glc-1-P 連接到此引子上，成為較長的直鏈澱粉 (amylose)，因此可用碘液呈色觀察。

在原態電泳膠片，澱粉磷解酶活性可利用此法染色，直接在膠片上看到酵素活性(如圖6.3A)。

c.小心其它干擾物質： 澱粉磷解酶的兩種基質很容易受到其它酵素的作用：可溶性澱粉受到 b-amylase (BA)澱粉酶快速水解，澱粉磷解酶活性會被抑制。

而Glc-1-P受phosphatase(Ph) 磷酸酶的水解，產生游離的磷酸，會誤判為澱粉磷解酶的活性(圖6.3B)。

▲ 　 [Enzyme activity] 　 　 　 　 　   　    [Alcohol dehydrogenase]                 　 ▲   　    　 　 　 　 　   　   　    　 　 　 　 　   　 　 6.3  維持酵素活性：   酵素是有活性的分子，因而可能隨時失去活性，應該考慮各種最佳的環境與條件，以便使酵素保持在最安定的狀態，其中酵素的緩衝液是最關鍵的因素。

6.3.1緩衝液： 緩衝液可維持酵素溶液的恆定酸鹼度及離子濃度，兩者都會影響酵素的活性，請複習生物化學中緩衝液的作用原理。

a.緩衝液有其使用範圍： 各種緩衝液都有其適用的pH範圍，表6.1列出常用的緩衝液。

表6.1各種常用緩衝液及其使用範圍：   緩衝液 適用 pH 使用上注意   Formate 3.0~4.5 容易揮發，可用冷凍乾燥除去    Citrate 3.0~6.2 小心會與二價金屬離子結合   Acetate 3.7~5.5 容易揮發，可用冷凍乾燥除去 ◎ Phosphate 5.8~8.0 小心會與鈣離子結合沉澱，低溫下易結晶   HEPES 6.5~8.5 毒性較小，多用在細胞培養 ◎ Tris 7.1~8.9 pH受溫度影響很大，要用特殊電極   Borate 8.1~9.0     Carbonate 9.7~10.7 小心會與金屬結合沉澱   Universal 2~12 數種不同pH範圍的緩衝液混合而成 ◎兩種最常用的緩衝液，注意其使用上的特性。

b.添加物都有作用： 經常在緩衝液中加入一些物質，以增加酵素安定以保持活性(表 6.2)，要小心這些添加物是否影響活性分析，是否影響下一步實驗。

(參考6.3.3) 表6.2緩衝液常用的添加物： 添加物質  作 用 一般使用濃度 NaN3 (sodiumazide) 抑菌劑 0.01% EDTA,EGTA 除去二價離子 0.1~1mM b-Mercaptoethanol 抗氧化劑 1~10mM Dithiothreitol(DTT orDTE) 抗氧化劑 1~5mM BSA(bovineserum albumin) 安定劑 0.1~10mg/mL Tween-20,Triton X-100 界面活性劑 0.5~0.05% Glycerol,glucose 防凍劑 50% Urea 尿素 變性劑 6~8M PMSF,TPCK,TLCK, benzamidine 等 蛋白酶抑制劑 通常微量使用 c.溫度的影響： 緩衝液用來維持溶液恆定pH，請注意有些緩衝液的pH受溫度影響很大(如 Tris)。

故製備緩衝液時，要考慮此緩衝液將要在何種溫度下使用。

d.濃度的影響： 改變緩衝液的濃度，可能會影響其 pH。

使用不同緩衝液，酵素活性表現也會有差異，有些酵素甚至失去活性。

通常若環境的pH變化較大，則需要使用較濃的緩衝液，圖6.4 列出各種實驗情況下，緩衝液的使用濃度範圍。

e.Stocksolution： 緩衝液可以十倍濃度貯存，高濃度可防止微生物生長，並保持每次實驗所使用藥品的穩定度與一致性。

注意在稀釋後，溶液的pH 也許會有改變，尤其是磷酸緩衝液很容易受到濃度改變而影響其pH。

6.3.2試劑的保存： 試劑的適當保存非常重要，要依照廠商所指示的溫度貯存。

a.避免潮解： 注意每當試劑由冷藏庫取出時，要等它回到室溫後才能打開，否則水氣會附在藥品的表面，進而潮解或破壞之。

b.分裝凍藏： 常用的冷藏藥品以小量分裝(aliquot) 後凍藏，是最好的貯藏方式，尤其是溶液狀態的生物活性試劑(如酵素)，切勿反復凍結-解凍。

有些酵素經不起凍藏，一旦結冰後再解凍，活性快速下降 (為什麼？)。

例如上述澱粉磷解酶請勿凍藏，放在4℃即可。

c.甘油凍藏： 於低溫(-20℃)貯藏的酵素溶液，若保存在50% 甘油就不會凍結，隨時取用。

但請注意所含的甘油，對下一步反應有無影響。

d.避光防菌： 很多試劑要避光貯存，或須放在乾燥器中，避免長霉長菌。

6.3.3酵素活性之維持： a.酵素的安定性不同： 酵素在細胞中合成後，有的分泌到細胞外，有的運送到細胞器官中貯存或應用。

前者 (分泌性酵素) 因為要在細胞外的惡劣環境中生存，因此較為堅韌，不易受到破壞；反之，細胞內的酵素，都以較濃的濃度集中在保護良好的胞器內或胞膜上，一旦抽離細胞暴露在氧氣中，可能很容易失去活性。

b.酵素失活的原因： 可歸類成如下的物理性或化學性原因。

(1)蛋白質變性： 離開細胞的生理環境後，蛋白質可能遇到極端的pH條件、不適的溫度、冰凍時被冰晶破壞，或使用變性劑(如SDS、尿素)，均會使蛋白質的構形破壞。

(2)酵素活性區破壞： 在抽取過程中，若失去cofactor，或者活性區的關鍵胺基酸被修飾，均可造成。

最常見的影響是氧化，尤其是cysteine上的-SH 基很容易被氧化。

一般加入EDTA除去可活化氧分子的二價離子，或加入抗氧化劑以其自身氧化防止-SH基氧化。

(3)蛋白酶水解： 細胞內有許多蛋白酶，細胞被打破後即釋放到酵素溶液中，很快水解酵素。

可用蛋白酶的抑制劑防止之，但蛋白酶有數大類，各有不同類的抑制劑。

一般使用 PMSF(phenylmethylsulfonylfluoride)是Ser型蛋白酶的抑制劑，但也抑制部分其它類型者，注意 PMSF在水溶液中很快就會降解，每次使用都要重新補充。

(4)酵素抑制劑： 在自然界中或以人工合成，發現許多酵素有抑制劑，可以專一性地抑制酵素活性；有可逆性的，也有不可逆的，通常不可逆抑制劑的效果都很強烈。

c.如何保持活性： 若你的酵素不太穩定，活性不易保持，請參考下列處理方式： (1)儘快進行純化及各項分析，隨時保持在4℃或冰浴中。

(2)讓酵素保存在硫酸銨固体沉澱中，要比溶液狀態安定得多。

(3)勿讓高純度的酵素，保存在稀濃度溶液中，否則要加BSA當安定劑。

(4)勿隨意凍結或解凍酵素液，可加防凍劑(如甘油或醣類)以液態保存。

(5)冷凍乾燥雖可長期保存酵素，但有些酵素活性可能會因而下降。

(6)若容易受微生物污染，可經無菌過濾後保存(當然也會損失一些酵素)。

6.3.4酵素活性單位： a.活性單位 (activityunit,U)是酵素活性高低的指標。

一個活性單位的標準定義，是在固定溫及pH下，每分鐘可催化1 mmole 基質的活性。

但很多情況下，為了操作或計算的方便，直接用測定產物所得的吸光值，除以單位時間來表示活性，因此各種活性單位的定義可能不同，請特別注意。

b.在提到酵素活性單位時，通常有兩種意思，一是指該酵素的總活性，單位就是 unit。

另外，因為酵素本身大多為蛋白質，因此有蛋白質的質量(mg)，而unit/mg 就是該酵素的比活性(specificactivity)。

比活性當然越高越好，表示在比較少量的蛋白質中，擁有比較多活性，比活性高者其酵素的純度也比較好。

c. 有關酵素活性及其基本背景，請複習生物化學中的酵素章節，你在大學所熟悉的基本酵素知識，在研究所或以後的任何階段，都還是完全適用。

▲ [Buffer] ▲ [Denaturation] (參考表6.2) [Enzyme activity] 問題集  (每個問題不一定都有標準答案，甚至會引起很大的爭議，但這就是問題集之主要目的)  1. 酵素活性的測定，可觀察反應物消失或者生成物生成，何者較佳？請述明理由。

[2]  2.活性分析時通常使用大量基質，要大到多少？(有一個公認的估計) 其目的何在？[3]  3. 在設計一個酵素活性分析方法時，應當注意那些要點，以免低估酵素活性？[3]  4. 酵素的催化條件受環境因子影響很大，而在試管中的反應與在細胞內的催化環境，一定有很大的差異，請儘你所知舉出兩者的差別，並說明其利弊。

[3]  5. 酵素催化反應時若能把生成物除去，有何好處？如何以物理或化學方法去除之？[3]  6.測定酵素活性為何要中止酵素反應？何種情況下可以不必中止反應？ [3]  7.NAD+ 如何進行其輔酶的作用？請寫出其構造式。

[1]  8.NAD+為何能在340nm 波長的吸光有變化？[1]  9.NADH與NADPH有何不同？能否互相通用？[2] 10.340nm應當使用UV或者可視光的光源？ [2] 11.若生成物無法直接偵測，則要如何進行活性分析？[2] 12. 分析酵素活性時，雖然耦合反應與主反應一起連續著進行，但在反應動力學及實驗操作上，或者反應過程中基質及生成物的濃度上，二者有相當的差別，請檢討兩種反應的異同點。

[4] 13.在酵素活性分析時，佐以耦合反應，有何好處？但有什麼可能的缺點？[3] 14.請詳究澱粉磷解酶(starchphosphorylase) 的催化反應，請列出所有可能的活性分析方法。

[2] 15.何為還原醣？為何蔗糖不是還原糖，而葡萄糖及果糖則是？[1] 16.請寫出轉化酶(invertase) 的催化反應，並舉出可能的生成物偵測方法。

[2] 17.請幫轉化酶設計一個使用放射線的活性分析方法。

[3] 18.Phytochelatinsynthase(PCS) 催化以下的反應，請幫忙設計活性分析方法：[3*] g-Glu-Cys-Gly + g-Glu-Cys-Gly → g-Glu-Cys-g-Glu-Cys-Gly +Gly 19.有那些試劑或處理方式可以使蛋白質變性？其原理或機制各為何？[1] 20.為何改變pH可以使得蛋白質沉澱下來？其變性的機制為何？[2] 21.某化學小分子上有兩個官能基，其解離常數pKa分別為4.5及 11，請問這個小分子的等電點大約多少？這個小分子能否作為緩衝液？可以作為多少pH的緩衝分子？[2] 22.請試著默寫Henderson-Hasselbalch 平衡式，並以此平衡式解釋，為何弱酸或弱鹼具有緩衝環境pH的作用？[3] 23.EDTA與EGTA有何不同？在使用上有何差異？[1] 24.使用放射性試劑時，何謂pulse-chase？在實驗上有何用途？ [3] 25.許多酵素在冰凍後受到傷害，活性因而下降，為此經常把酵素放在含有50% 甘油的緩衝液中，凍藏在-20℃中就不會結冰，可以直接取出來使用，非常方便。

某生以此方式保存酵素，但每次取出來做活性分析時，分別取出 10到100mL 体積，想要做一條校正直線(酵素体積vs 活性)，但是無論嘗試幾次，這條直線的精準度都很差，檢測點大多無法落在直線上，請幫忙找出可能的原因，並且建議改善方法。

[4*] 26.通常要進行活性分析的樣本都要稀釋，若某酵素的稀釋度為1:10 時，測得2U/mL的活性；當稀釋為1:50時，活性為0.6U/mL；稀釋1:1000時，活性為0.05U/mL。

請問你應當如何判別所得數據？如何取捨？為何有這樣的情形？ [5*] 27.酵素的活性單位有一個公認的定義，請寫出如何定義1unit 活性單位。

另外，活性單位也容許各自定義，且有其正當理由，請說明為何。

[3] 28.酵素試劑通常都很貴，某生要購買酵素X 做為實驗的標準品，發現廠商有多種形式如下，請問你如何幫他訂購最合適的種類？刮號內為美元報價。

[5] TypeX-1:1,000units/1gm(USD10.00), TypeX-2:100 units/1mg(USD100.00) TypeX-3:1,000units/10gm(USD5.00), TypeX-4:50units/0.1mg(USD 500.00) 29.請由右圖澱粉磷解酶L-SP的酵素動力學實驗結果，推測兩種基質 (澱粉及Glc-1-P)與酵素之間的交互作用關係。

[5*] (也請解答 Pur0酵素實驗室問題集：7~15題) [題目後面方括號內的數字代表該題的難易程度，3為中等而5最難回答，標有* 為實際問題] ▲　 > 酵素純化 > 7 電泳檢定 ▲ ■■■ 本網頁最近修訂日期： 2020/09/19