一篇案例說明RNA-seq在疾病診斷中的重要價值

肌肉功能失調是一種罕見疾病，分類複雜，根據不同的表現形式，包括貝克爾肌肉萎縮症、先天性肌營養不良症、杜氏肌萎縮症、肢帶肌萎縮症等20幾種。

目前對於這種罕見疾病的診斷主要是通過外顯子測序和全基因組測。

儘管這種方法逐漸成為常規的診斷，但是經過DNA水平檢測準確率最高也不會超過50%。

本研究另闢蹊徑，採用DNA結合RNA-seq的方法，將整體診斷率提高了35%，且看研究者是如何進行深入分析提高診斷率。

標 題：轉錄組測序提高孟德爾疾病的遺傳診斷

Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing

雜 志：science translational medicine，2016

IF= 16.796

研究背景

外顯子測序和全基因組測序逐漸成為孟德爾疾病診斷的常規方法。

儘管這種方法很成功，但是對於罕見疾病的基因分析後的診斷率大概在25%-50%。

研究者將RNA-seq方法作為補充，對50個從遺傳角度未被確診的肌肉失常患者進行研究。

研究者文章描述了一個綜合的方法，分析原發性肌肉疾病(肌病和肌營養不良)患者的RNA數據，利用分析框架集中發掘患者獨特的轉錄水平變化。

材料方法

1. 實驗方案

①取樣方案

分組

實驗組：63名肌肉失常原發性肌肉疾病（20種）患者-肌穿刺樣本；

對照組：來源於GTEx資料庫的184個不同個體來源的骨骼肌RNA數據；

樣本選擇標準

對照組樣本選擇標準：RNA RIN值缺血時間和表型特徵：如年齡, BMI，死亡原因

實驗組樣本選取標準：

1）已確診病人選擇：遺傳分析至少有一個基因功能缺失或剪接位點變異；N=13

2）具有候選延展剪接位點變異，且致病性功能未知樣本；N=4

3) 有強烈的候選基因的樣本，如臨床上肌營養不良蛋白表達減少;N=12

4）基於WES或WGS無強烈的候選基因的樣本。

N=34

②測序策略

RNA-seq:Ilumina Hiseq 2000 PE 76 50-100M

WES：Ilumina Hiseq PE 76

WGS:Ilumina X-ten PE 151

2. 技術路線

研究結果

1、PCA分析結果

對247個樣本進行PCA分析，結果顯示：

a.基於聚類結果，剔除兩個患者的樣本，（聚類上這個兩個樣本更傾向於脂肪組織）， 剔出後的樣本與組織污染或晚期退化性肌肉病理一致。

b.GTE來源的control肌肉組與患者肌肉樣本重疊在一起，活檢組織存在正常組織的污染。

（可能是組織活檢獲得的樣本包括了正常的皮膚和脂肪樣本），下圖為剔出後的結果：

2、可變剪接分析

研究者自己編寫了代碼進行可變剪接的分析，條件篩選如下：

（代碼獲取連結： https://github.com/berylc/MendelianRNAseq ）

基於split-mapped reads挖掘致病性可變剪接事件：

1）僅考慮唯一比對的reads，且為非允余序列；

2）對於比對注釋獲得的的junction reads ，進行局部的標準化；

3）統計splice junction 在樣本中的出現的情況，以及在每個樣本的reads支持度及其標準化後值。

過濾參數，基於原來被鑑定出來的已知的致病性剪接事件鑑定出的參數為篩選標準。

結果：每個樣本識別的致病性可變剪接體的中位數：神經肌肉疾病相關基因5個, OMIM 基因26個, 所有基因190個。

經過RNA-seq分析獲得了可能的致病性可變剪接體，主要類型為，外顯子跳躍、外顯子延伸、外顯子和內含子拼接，對獲得的剪接體並進行了qpcr驗證，結果一致。

B圖：線狀體肌病患者，DNA水平檢測為移碼變異，RNA-seq鑑定顯示為NEB基因A-G變異導致的外顯子延伸,引入一個過早的終止密碼子，提前終止基因轉錄形成一個隱性等位基因。

C圖：DNA測序經常可以篩選得到某些基因的大量變異，但是對於病例上的解釋較難，如TTN基因，在轉錄水平上找到了一個錯義突變體，產生了新的變異體。

D圖：非編碼致病性突變體鑑定-DMD基因：內含子中C-T的變異形成偽外顯子，形成新的內含子致病性突變體，在3個患者中檢測到。

Types of pathogenic splice aberrations discovered

來自具有嚴重杜氏肌營養不良症的患者的RNAseq僅顯示到偽外顯子的剪接，在具有較輕的貝克肌營養不良表型的兩名患者中觀察到注釋外顯子之間的野生型剪接，暗示功能性DMD的其他的類型的轉錄本可以解釋溫和性的疾病。

3、膠原VI相關性營養不良中復發剪接位點產生變體

轉錄組測序功能的一個顯著的例子是我們發現了嚴重膠原VI相關營養不良的遺傳亞型是由膠原蛋白的1個基因中的突變引起。

對4個嚴重膠原VI相關營養不良患者進行分析，如下圖：膠原VI蛋白相關基因COL6A發生了由GC>GT的變異，形成一個72 bp的偽外顯子，並產生一個新的可變剪接體。

偽外顯子所得到的24個胺基酸發生在COL6A1基因的N末端三螺旋膠原G-X-Y重複區域內，新的可變剪接體破壞了這種結構，並確定了其在各種膠原性疾病中可引起顯性致病性。

4、RNA-seq診斷率

上圖為63名患者經DNA-seq結合RNA-seq最終結果，從左到右四個柱子意義如下：

左數第一個柱狀：13名以前分析確診的患者。

第二個柱子：4名患者以前的遺傳分析確定了未知意義的擴增剪接位點變體，其中2個RNA-seq結果的患者的延伸 的可變剪接位點變化顯著，可確診。

第三個柱子：12名以前遺傳分析確定的具有強烈的候選基因的患者，8個RNA-seq解決-非編碼致病變異。

第四個柱子：34名以前遺傳分析為檢測到強烈候選基因的患者，7名患者RNA-seq解決。

總之，RNA-seq對未被確診的35%的患者進行了確診。

文獻亮點

1、本研究在方案設計上，打破了傳統的思維定式，不是針對某一種基因型樣本進行選取，而是對於感興趣的疾病所有的不同類型都進行了取樣及研究，在臨床上更接地氣；

2、在臨床上常規DNA手段無法確診的罕見疾病，聯合RNA-seq對於未被確診的病人及無法解釋的基因變異做了深入的解析；

3、臨床的應用價值：提示RNA-seq與DNA-seq相結合的重要性。