小鼠心脏灌流、脑组织解剖与固定 - Bio-protocol

摘要：在对脑组织进行切片和免疫染色或原位杂交等实验之前，为了排除血液对实验的干扰，通常会用生理盐水对小鼠心脏灌流后再进行解剖和切片。

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在灌流时，既可以在左心室插针，也可以经由左心室对主动脉进行插针，后者有助于提升灌流速度和成功率。

生理盐水灌流结束后，通常继续灌流多聚甲醛固定脑组织，并在剥离取脑后再进行更长时间的后固定，以便后续切片开展实验。

关键词:小鼠,心脏灌流,主动脉,多聚甲醛,固定 材料与试剂 量筒(蜀牛) 烧杯(蜀牛) 温度计 生理盐水(0.9%氯化钠溶液) 1.5%戊巴比妥钠溶液(溶于生理盐水中) NaH2PO4•2H2O(沪试，catalognumber:20040718) Na2HPO4•12H2O(沪试，catalognumber:10020318) 多聚甲醛(Sigma，catalognumber:158127) NaOH(沪试，catalognumber:10019718) HCl(生工，catalognumber:10011018) 去离子水 4%多聚甲醛溶液[溶于0.1M磷酸缓冲液(PB)，pH7.0~7.4，见溶液配方] 仪器设备 通风橱 解剖镊(瑞沃德，catalognumber:F12018-13) 眼科镊(瑞沃德，catalognumber:F12006-10) 止血钳(瑞沃德，catalognumber:F21002-12) 解剖剪(瑞沃德，catalognumber:S13052-12) 精细剪(瑞沃德，catalognumber:S12005-10) 血管夹(瑞沃德，catalognumber:R33001-48) 称量勺(FisherBrand，catalognumber:21-101-10) 1毫升无菌注射器(洪达，catalognumber:zsq08) 4号或5号静脉输液针(丰临) 20毫升注射器(洪达，catalognumber:zsq08) (可选)恒流泵(LONGERPUMP，catalognumber:BT100-2J) 带加热装置的磁力搅拌器(SCILOGEX，catalognumber:MS7-H550-Pro) 分析天平(SARTORIUS，catalognumber:BSA124S) 微型台式真空泵(LONGERPUMP，catalognumber:BT100-2J) 50毫升离心管(THERMO，catalognumber:339652) 0.22微米PVDF瓶顶过滤器(ThermoFisher，catalognumber:291-4520) 图1.手术器械 实验步骤 术前准备 1.1 称量小鼠体重并记录(精确到克)。

根据小鼠体重，按照每10克体重注射0.06毫升的剂量，用1毫升无菌注射器吸取适量1.5%戊巴比妥钠溶液备用。

1.2 拎起小鼠尾部，将小鼠置于笼架上。

一手拉住小鼠尾部使其抓紧笼架、身体绷直，另一只手按住小鼠颈部后，尽可能多地捏住小鼠颈部皮肤，固定小鼠身体，保证小鼠在注射过程中不会移动。

      图2.小鼠抓取与腹腔注射 1.3 将小鼠翻转至腹部朝上，在偏左或偏右的下腹部进针，腹腔注射1.5%戊巴比妥钠溶液。

进针不需太深以避免刺入脏器，有明显穿透感但无阻碍感即可(图2)。

1.4 将小鼠放回笼内，等待约5分钟，挤压小鼠脚趾或尾部，观察其是否失去反应，以确认是否进入深度麻醉状态。

注：对于出生6天以内的新生小鼠，可采用低温麻醉。

将新生小鼠放入纸筒、塑料管或包裹在乳胶手套中(可剪下乳胶手套的拇指部分用于放置小鼠)，用碎冰埋至颈部，保持10~15分钟以达成深度麻醉状态。

麻醉状态在常温下仅能保持约10分钟，因此不能将小鼠长时间留在手术台上，应尽快进行手术。

1.5 (从此步骤起，在通风橱中进行操作)确认小鼠进入麻醉状态后，将其腹部向上摆放在聚苯乙烯泡沫塑料板或软木材质的手术台上，四肢用胶带或针头/大头针固定，使其在灌流过程中无法随意移动。

      注：若麻醉过量导致小鼠心脏停跳，应尽快开始灌流，避免凝血导致灌流不畅。

1.6 剪去中国国家标准4或5号(对应于国际通用标准的25G或27G)静脉注射针针头尖端的一部分，使其略微变钝(图3)，以防进针时刺破主动脉壁。

图3.修剪针头(A)未修剪针头(B)修剪后针头 1.7 将静脉注射针连接到提前吸满生理盐水的20毫升注射器上。

1.8 取另一20毫升注射器，吸满4%多聚甲醛溶液备用。

主动脉灌流 2.1 用眼科镊拉起胸腔外侧皮毛，用解剖剪剪去皮肤，暴露白色剑突。

2.2 用眼科镊拉起剑突，用解剖剪沿剑突下方横向剪开肌肉层，暴露横膈膜。

2.3 用精细剪小心剪开横膈膜，注意不要伤到上方的心脏。

2.4 沿胸骨外侧剪开两侧肋骨，翻开胸廓前壁并用止血钳固定(或者将此部分组织完全剪除)，以使得心脏完全暴露，可看到颜色较深的右心室(静脉血)以及颜色较浅的左心室(动脉血)(图4)。

图4.开胸后示意图 2.5 用眼科镊及解剖镊清理心脏周围脂肪组织，暴露升主动脉。

2.6 用眼科镊固定心脏，从左心室紧靠心尖处，以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针(图5A)。

由于针尖已经修钝，进针时会有一定的阻力感；成功穿透心室壁时，会有明确的穿透感(图5B)。

切忌用力过猛，或角度过偏，否则有可能穿过左右心室的间隔，进入右心室，或是直接扎穿整个心脏。

2.7 继续沿着初始方向进针，若方向准确，将不会感到明显阻力，并在针头进入主动脉时透过主动脉壁，观察到针头(图5C~D)。

即刻用血管夹夹在针头处(图5C箭头位置)，将其固定于主动脉内。

注： 如果不能成功将针头插入主动脉中，也可将其留置于左心室中(进针约0.5厘米深度)，用止血钳夹持固定(图5B箭头位置)，或者用大头针或针头插在手术台上辅助固定。

成功进针后，随着心脏的搏动可见回血。

小于一周龄的幼鼠由于心脏很小，主动脉进针难度很大，且不便用血管夹或止血钳固定针尖与心脏，可考虑采用10毫升手持注射器进行心室灌流。

图5.进针步骤。

(A)于左心室尖端，以大致平行于心脏左右中线的角度刺入注射针。

(B)进针约0.5厘米后，可将针头留置于左心室中进行灌流。

注意进针方向，避免刺穿左右心室之间的隔膜(空心箭头)。

(C~D)继续进针，即可将针头送入主动脉中(C，白色箭头)，透过主动脉壁能够观察到针头所在(D，白色箭头)。

利用血管夹固定后，即可进行灌流。

(A~C)为示意图。

(D)为实际进针情况。

(E)灌流前肝脏呈深红色。

(F)生理盐水灌流后失血的肝脏。

若一直保持血色或有不均匀的血块，则说明灌流效果不佳。

2.8 用精细剪在右心房上剪开一个小口，将观察到深红色血液流出。

2.9 手持针管，匀速推注生理盐水，速度约为每5秒1毫升。

当针头留置在心室而非主动脉时，应适当调慢速度。

除针筒外，也可使用蠕动泵灌注，以更好地控制速度。

若进针位置正确，左右心室间隔无破损，将观察到右心房持续流出血液，肝脏逐渐失血(图5E~F)。

若进针位置不准，致使生理盐水直接进入右心室，可能会观察到肺部膨大，甚至有液体从鼻尖流出。

若肝脏不能完全失血，保留不均匀的红色，则说明灌流效果不佳。

注：若进针角度有误或过深导致扎穿心脏或进入右心室，应及时退针重进，一般不会影响灌流效果。

2.10 待观察到流出液体变澄清，肝脏完全失血后，可停止生理盐水灌流。

一般成年小鼠生理盐水的灌流量约为15~20毫升。

视频1.小鼠心脏灌流。

4%PFA灌流 3.1 将静脉注射针换连到提前吸满4%多聚甲醛的20毫升注射器上，注意不可引入气泡。

3.2 手持针管，匀速推注多聚甲醛，速度约为每5秒1毫升。

当4%多聚甲醛流经小鼠身体时，可观察到肌肉收缩、胸腔上拱、尾巴翘起摆动等现象，用手触摸颈部可感到较为僵硬，肝脏颜色略微变黄。

一般成年小鼠灌流用量约为15~20毫升。

3.3 灌流结束后拔出针头，将小鼠从手术台上取下。

整个小鼠身体将呈僵直状。

剥离鼠脑 4.1 用解剖剪断颈，剪下小鼠头部(图6水平虚线，从颈部向鼻尖方向剪开头部上方的皮毛(图6带箭头虚线)，暴露出颅骨。

4.2 用解剖剪切除脑干，用精细剪剪除颅骨周围肌肉，暴露颅骨底部枕骨。

4.3 将精细剪单侧刀刃平行于鼠脑底部插入枕骨下方，向外分别剪断两侧颅骨。

4.4 用解剖镊小心摘除覆盖小脑的颅骨。

4.5 将精细剪的单侧刀刃从颅骨中缝处插入，刀刃一侧朝向颅骨，避免损伤脑组织，沿中缝剪开大脑上方至嗅球上方颅骨。

直于鼠脑顶部插入中缝剪开颅骨，用解剖镊小心剥离。

图6.剥离鼠脑。

(A)断颈，从颈部朝鼻尖方向(虚线)剪开头部上方皮毛，暴露颅骨。

(B~C)沿虚线剪除脑干以下的颅骨，依次移除小脑和大脑部位的颅骨，暴露脑组织。

4.6 用称量勺(或其他平面钝头工具)从鼠脑底部平行插入到嗅球底部，切断下方神经束，取出鼠脑。

4.7 将鼠脑放入4%多聚甲醛溶液，4度后固定过夜。

     注：成功灌流的鼠脑颜色呈浅黄色，组织较硬；若血液灌流不彻底，则可能整体或局部呈现血红色，组织较软。

后固定后鼠脑体积缩小，颜色加深(图7)。

图7.不同灌流状态鼠脑外观。

(A)未灌流鼠脑,外观呈红色，可见明显红色血管分布;(B)灌流失败鼠脑，整体外观呈现粉红色;(C)灌流成功且未进行后固定鼠脑，整体颜色较白;(D)后固定后鼠脑体积略微缩小，颜色略微加深。

4.8 将后固定结束的鼠脑转入含有0.01%叠氮钠的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，4度保存；或转入30%蔗糖溶液，待沉底后负20~80度冰冻保存。

失败经验     表1. 常见问题分析及解决方案 溶液配方 4%多聚甲醛的配制(以4L为例，配制其他体积可参见表2) 用去离子水清洗量筒、烧杯等； 使用一次性称量船，分别用分析天平称取12.481克二水合磷酸二氢钠与114.605克十二水合磷酸氢二钠，溶于2升去离子水中； 将溶液放置于微波炉中最高火加热，每隔3~5分钟取出测量温度，直至溶液温度到达60度； 用分析天平称取多聚甲醛干粉160克，倒入烧杯底部，避免粉末飞溅； 注：需穿戴好口罩等防护用品，避免吸入粉末。

 在通风橱内将预热后的磷酸缓冲液倒入盛有多聚甲醛的烧杯； 将烧杯置于磁力搅拌器上，加入磁力搅拌子，开启磁力搅拌器；打开加热板，设置恰当的加热档，保持烧杯内溶液温度在50~60度之间。

待多聚甲醛充分溶解后，加去离子水定容至4升。

注：可加入1毫升5摩尔/升氢氧化钠溶液助溶，待多聚甲醛溶解完全后，加入等摩尔量的盐酸中和。

若使用12摩尔/升盐酸，则需加入0.4毫升。

配置5摩尔/升氢氧化钠溶液：在50毫升离心管中称量约2克氢氧化钠，加入10毫升去离子水，轻柔摇晃溶解。

氢氧化钠溶解时大量产热，故切勿盖盖或或剧烈摇晃，以防离心管爆炸或溶液飞溅； 将0.22微米PVDF瓶顶过滤器与微型台式真空泵相连，过滤多聚甲醛溶液； 过滤后的溶液分装入50毫升离心管，-20度冻存； 注：每管体积不超过45毫升，以防冰冻后体积增大，溶液溢出。

冻存后的多聚甲醛溶液使用前可放置4度或室温融化，并充分颠倒混匀。

   表2.配制不同体积4%多聚甲醛的药品配比   注：由于甲醛干粉易飞，溶液挥发也会刺激眼睛和呼吸道粘膜，称量和分装需佩戴口罩、护目镜等护具。

伦理学声明 本实验对小鼠进行的所有研究行为均遵循和符合国家《实验动物管理条例》和有关动物保护与使用的法律和法规，并获得复旦大学实验动物中心动物伦理委员会批准。

参考文献 Gage,G.J.,Kipke,D.R.andShain,W.(2012).Wholeanimalperfusionfixationforrodents.JVisExp(65). https://www.mcgill.ca/research/files/research/305-_transcardiac_perfusion_-_jan_2018_1.pdf https://www.mbl.edu/bie/files/2015/01/mouse_transcard_perf11.pdf Pleaseloginorregisterforfreetoviewfulltext Viewfulltext DownloadPDF Q&A Copyright: © 2020 TheAuthors;exclusivelicenseeBio-protocolLLC. 引用格式：蔡予琦,吴锦云,吴晓阳,应玥,邰一琳,何苗.(2020).小鼠心脏灌流、脑组织解剖与固定.Bio-101:e1010353.DOI:10.21769/BioProtoc.1010353. Categories Neuroscience > Cellularmechanisms > Celladhesion CellBiology > Tissueanalysis > Tissueculture Q&A Ifyouhaveanyquestions/commentsaboutthisprotocol,youarehighlyrecommendedtoposthere.Wewillinvitetheauthorsofthisprotocolaswellassomeofitsuserstoaddressyourquestions/comments.Tomakeiteasierforthemtohelpyou,youareencouragedtopostyourdataincludingimagesforthetroubleshooting. Ifyouhaveanyquestions/commentsaboutthisprotocol,youarehighlyrecommendedtoposthere.Wewillinvitetheauthorsofthisprotocolaswellassomeofitsuserstoaddressyourquestions/comments.Tomakeiteasierforthemtohelpyou,youareencouragedtopostyourdataincludingimagesforthetroubleshooting. AllField Findoutmore Weusecookiesonthissitetoenhanceyouruserexperience.Byusingourwebsite,youareagreeingtoallowthestorageofcookiesonyourcomputer.