循環腫瘤DNA在乳腺癌內分泌治療耐藥中的應用

作者：劉斌亮 馬飛 曾益新

單位：北京協和醫學院 中國醫學科學院腫瘤醫院腫瘤內科

乳腺癌是全世界最常見的女性惡性腫瘤，70%～75%的乳腺癌患者雌激素受體陽性。

針對雌激素受體陽性的患者，內分泌治療可以顯著減少乳腺癌患者的復發並延長總生存期，因而是極為有效的治療方法之一。

但在治療過程中，多數患者將產生繼發性內分泌耐藥。

內分泌耐藥相關基因及耐藥機制

雌激素受體信號通路非常複雜並且與多個生長通路交叉成網，因此出現內分泌耐藥的機制很多。

內分泌治療耐藥的主要機制如下：①雌激素受體結構和功能異常，如雌激素受體-1（ESR1）突變或擴增；②生長因子信號通路增強或激活，例如人表皮生長因子受體-2（HER-2）、表皮生長因子受體（EGFR）、成纖維細胞生長因子受體等基因的突變或者擴增，下游信號分子磷脂醯肌醇3-激酶（PI3K）異常，包括磷脂醯肌醇3-激酶催化亞單位（PIK3CA）、哺乳動物雷帕黴素靶蛋白（mTOR）突變，以及絲裂原激活的蛋白激酶／胞外信號調節的蛋白激酶（MAPK/ERK）信號通路的激活等；③細胞衰老和凋亡相關基因突變，例如Tp53突變；④細胞周期調節機制的異常，如細胞周期素D1擴增等；⑤細胞微環境異常。

其中，目前研究比較多的耐藥基因突變或擴增主要包括ESR1、PIK3CA、HER-2、成纖維細胞生長因子受體-1、細胞周期素D1等。

利用循環腫瘤DNA監測內分泌耐藥突變

為了利用基因突變來指導乳腺癌的內分泌治療並準確判斷預後，在乳腺癌病程中定期監測耐藥突變是十分必要的。

但是反覆使用傳統的組織活檢有很多局限之處：①組織活檢不方便，特別是對於某些腫瘤部位較深、標本不易獲得的患者；②腫瘤的異質性導致組織活檢常常不能反映腫瘤整體情況；③反覆活檢會給患者帶來風險及各種併發症；④傳統組織標本不易保存（如使用甲醛固定石蠟包埋的標本）。

隨著外周循環腫瘤細胞（CTC）和循環腫瘤DNA（ctDNA）檢測技術的發展，人們有了可以克服傳統活檢缺點的新方法。

CTC是從腫瘤上脫落並進入循環系統的癌細胞，可以利用血液標本對其進行定性和定量分析，從而了解腫瘤的諸多信息。

ctDNA是腫瘤細胞通過壞死、凋亡或直接分泌的方式向血液中釋放的游離DNA。

ctDNA常攜帶腫瘤相關的單核苷酸、拷貝數及結構等遺傳變異，這一特點促使ctDNA成為潛在的生物標誌物。

相對於CTC，ctDNA有非常高的敏感性以及較快的檢出速度，因而得到了廣泛的應用。

利用ctDNA檢測乳腺癌的突變並以此為基礎確定臨床治療策略的想法正在快速實現。

ctDNA檢測技術

ctDNA在血液中含量很低而且不同個體間相差巨大，因此需要高敏感性的檢測設備和方法以保證檢測質量。

目前檢測ctDNA突變的方法主要有微滴數字PCR（ddPCR）和新一代測序（NGS）。

ddPCR和NGS測序技術各有優缺點。

NGS技術成熟時間早於ddPCR，其測序優點在於發現突變的「廣度」，可以給出基因突變的「全景」，包括點突變、缺失、擴增、融合和易位，可以揭示基因組的複雜性和腫瘤的遺傳異質性，了解腫瘤的侵襲性、復發風險，在未知遺傳變異的探索中有著不可替代的優勢。

雖然NGS有很高的通量，可以在一個實驗中檢測出數百億個核苷酸的DNA序列。

但正因為如此，即便是1%的檢測錯誤率也將對NGS的檢測結果產生較大的誤差，極大限制了其測序深度，因此NGS測序最大的缺點就是相對較低的敏感性。

PCR技術主要包括實時螢光定量PCR、3D數字PCR（3dPCR）和ddPCR。

螢光定量PCR檢測ctDNA的陽性率顯著低於NGS測序，但ddPCR檢測ctDNA的陽性率高於NGS測序。

ddPCR技術是將DNA乳化後，將聚合酶鏈式反應分散到百萬個油滴中，每一個微滴包裹一個DNA分子，再用引物擴增，極大地提高了通量和準確性。

理論上，ddPCR可以檢測到最低0.001%的突變。

3dPCR與ddPCR不同的是，其反應載體使用的是固體晶片而不是乳化的微滴，因此3dPCR有更好的穩定性和較低的價格，但是檢測速度較慢，通量顯著低於ddPCR。

現在普遍認為ddPCR和3dPCR是最好的ESR1突變檢測平台。

長期動態監測內分泌耐藥突變在臨床中的應用

對ctDNA定量的檢測可以評價腫瘤大小、淋巴結受累、組織病理分級和臨床分期，而對ctDNA定性的檢測可以全面了解患者有無基因的突變或異常，從而指導治療並評價預後。

隨著時間的推移，乳腺癌可以失去和（或）獲得新的改變而發生演變，因此大量的研究肯定了在疾病的全程中定期檢測ctDNA耐藥突變的必要性。

根據目前研究成果，ctDNA中可檢測的與內分泌耐藥相關的基因突變頻率由高到低依次為Tp53、PI3K、ESR1、ERBB2擴增等。

目前利用ctDNA檢測耐藥突變多集中於ESR1、Tp53和PIK3CA三個基因突變，其中ESR1突變在ctDNA中檢測的應用已經較為成熟，而ctDNA檢測HER-2、細胞周期素D1或成纖維細胞生長因子受體擴增卻因腫瘤細胞染色體的不穩定性而發展受限。

HER-2擴增的檢測正在積極地嘗試中，相信即將會有所突破。

1.ctDNA檢測的可靠性

大量的研究已經肯定了ctDNA檢測ESR1具有較高的敏感性和準確性，ctDNA與組織活檢中ESR1突變檢測的相符度也可達57%～97%，是較為成熟的技術。

無獨有偶，Ling等證實ctDNA檢測Tp53、PIK3CA突變具有較高的敏感性。

Madic等、Board等、Higgins等則證實了ctDNA檢測Tp53和PIK3CA與組織活檢的高符合度（81%～100%）。

因為乳腺癌染色體的不穩定性，利用ctDNA檢測基因的擴增突變是目前技術的難點。

Gevensleben等將穩定拷貝數的EFTUD2探針作為參考，利用數字PCR檢測患者血液中HER-2／EFTUD2的比值，結果顯示陽性準確率和陰性準確率分別達到64%和94%，展現出了ctDNA對擴增突變檢測的強大潛力。

2.ctDNA指導治療的優勢

多個研究均發現ctDNA中耐藥基因突變率在乳腺癌的發生髮展中不是一成不變的。

ctDNA定量的變化是對治療反應的絕佳監測指標，尤其是比較治療後ctDNA水平的高低。

隨著內分泌治療的進行，ctDNA中ESR1突變逐步升高。

ESR1突變率越高，其對內分泌治療的療效越差，生存期也更短。

如果在內分泌治療期間，ctDNA中ESR1突變率突然升高常預示著腫瘤轉移以及內分泌耐藥突變的出現。

與ESR1突變相似的是，經過內分泌治療後ctDNA中的PIK3CA突變明顯升高。

Spoerke等發現乳腺癌患者出現影像學上的完全緩解或者部分緩解時，其ctDNA中ESR1及PIK3CA陽性率明顯下降。

但其實ctDNA中ESR1突變的動態變化常常早於影像學上可見的變化，利用ctDNA進行基因檢測最多可以比影像學早10個月發現內分泌耐藥。

因此，利用ctDNA檢測耐藥突變，可以極大地幫助臨床醫生及時調整治療方案，在乳腺癌的治療、療效評價中起到了重要作用。

利用ctDNA有助於更加有傾向性地制定治療計劃。

Wang等研究發現，腦轉移患者的ctDNA中ESR1突變率（34.3%～44.9%）明顯高於骨轉移患者（1.4%）。

提示ESR1可能是腦轉移的驅動基因。

因此，監測過程中如果出現ESR1陽性，在以後的治療中需要警惕腦轉移的風險。

Schiavon等的研究發現PIK3CA突變患者更容易出現ESR1突變，因此治療前即存在PIK3CA突變的患者，其內分泌耐藥檢測需要更加頻繁。

除此之外，Miller等發現PIK3CA突變可能是HER-2靶向藥物較好反應的預測。

Murtaza等發現紫杉醇治療後ctDNA檢出PIK3CA突變的頻率升高並預示出現紫杉醇耐藥。

3. ctDNA對預後的判斷

長期監測ctDNA對判斷預後有重要作用。

如前所述，ESR1陽性預示較差預後，並且在內分泌治療中越早出現ESR1突變，患者預後越差。

Liang等發現ctDNA中PIK3CA及Tp53突變預示不良的預後，且在病程中兩者陽性率的變化將反映治療效果。

Oshiro等也得出了同樣的結論，並認為ctDNA中PIK3CA突變率是比癌胚抗原和CA15-3更好的評估預後的指標。

但是PIK3CA突變對預後的影響仍存在一定的爭議。

比如Takeshita等發現PIK3CA突變陽性可以明顯延長三陰乳腺癌患者無復發生存期和乳腺癌特異性生存期，原因可能是PI3K通路突變與三陰乳腺癌的雄激素受體通路相互影響所致。

Sefrioui等、Gu和Fuqua提出了一個較為合理的監測體系和方法。

他們認為在乳腺癌患者接受治療前，可以使用NGS技術得出乳腺癌基線時的相關突變，了解如ESR1、PI3K、Tp53等基因突變的全貌以全面地評估腫瘤的情況。

針對性治療後再定期用ddPCR確認原先存在的突變，並比較治療前後的突變頻率是一種合理的方法。

利用ctDNA檢測的局限及問題

首先，目前的大部分研究均為回顧性、小樣本、單中心的，較大影響了結果的準確性。

較高的試驗費用也限制了其在臨床上的應用。

其次，各研究檢測標準的不統一，包括ctDNA的分離方法不同、檢測條件不一致、抽血節點不同等。

另外，耐藥突變基因的檢測常局限於幾個常見位點上，如ESR1的D538G、Y537N、Y537S，PIK3CA的E542K、E545K、H1047R等常見突變，這將漏掉其他一些內分泌耐藥的突變。

此外，部分學者認為非突變腫瘤細胞產生的ctDNA將「稀釋」突變的ctDNA，從而導致對疾病的低估，誤導臨床判斷。

ctDNA檢測耐藥突變多集中於ESR1、Tp53和PIK3CA三個基因，對基因擴增的檢測存在一定的難度，但是不少研究正在緊鑼密鼓進行中。

Gevensleben等成功地利用穩定拷貝數的EFTUD2探針作為參考，檢測HER-2擴增的方法，將為肝細胞生長因子受體、成纖維細胞生長因子受體-1、細胞周期素D1等其他擴增的檢測提供可能。

ESR1突變將會導致內分泌耐藥，但同一個基因的不同突變對內分泌藥物耐藥的機制和產生的影響不盡相同。

比如ESR1中最常見的Y537S與D538G突變之間就存在差異。

Toy等分析ESR1突變後基因表達及結構發現，Y537突變後雌激素非依賴性活性強於D538突變。

BOLERO-2試驗中也發現依維莫司僅能為D538G突變患者帶來無進展生存時間的獲益，而Y537S突變患者卻未見獲益。

因此，同一個基因內部的不同突變與內分泌藥物間有無進一步的關聯，值得深入研究。

ctDNA在內分泌治療前預測療效、內分泌治療中監測耐藥、評價乳腺癌預後中都有不可或缺的作用。

因此，ctDNA在乳腺癌患者中的應用價值是不言而喻的。

雖然有了NGS和ddPCR兩項技術可以幫助更好地檢測ctDNA中內分泌耐藥突變，但是部分常見的內分泌耐藥突變監測（如成纖維細胞生長因子受體-1、細胞周期素D1突變）的探索明顯不足，而且尚沒有直接證據表明藉助基因檢測的內分泌精準治療能改善患者預後。

因此，如何促進建立更合理的耐藥突變監測系統，以及如何利用ctDNA實現內分泌精準治療將是一個長期的任務。

節選自：國際腫瘤學雜誌2017年 10月 第44卷第10期