隨著測序成本的持續下降，幾種策略的價格差別在逐漸縮小，甚至智因的全外顯子和Panel價格出現了倒掛，同樣的價錢，過去只能做Panel，而現在可以做全外了，甚至比Panel更便宜。

在過去，醫生是出於為患者省錢才舍全外而做Panel的，常常為要選擇開哪個包而糾結，今後醫生再也不必為此而傷腦筋，所有的Panel就直接用全外代替就OK了。

全外比小Panel便宜了，但數據質量可一點也不亞於Panel，智因東方的全外，對於質檢合格的樣本，在平均測序深度100X的時候，20X以上覆蓋度均值可達99%，這樣的均衡性是很多捕獲Panel都望塵莫及的。

增強全外是在全外基礎上，增加了大型拷貝數變異（CNV）的檢出。

家系准全基因組（trio-sWGs™），是在增強全外的基礎上，增加了對人類全部四千多種致病基因的非編碼區的trio（一家三口）測序，可以檢測到近全部非編碼區的已知致病突變。

雖然這不是標準意義上的全基因組30X測序（WGS），但在致病突變相對密集的全外顯子和臨床非編碼區的區域可以獲得100X測序深度，其數據質量要遠勝於WGS。

家系全基因雙組學（trio-sWGRs ™），是在家系准全基因組的基礎上，增加了一家三口的外周血白細胞全轉錄組測序（RNAseq），可以檢測分析白細胞表達的近萬個基因的表達譜和各種剪切變體。

對於致病基因在白細胞表達並發揮功能的一些疾病，尤其是血液系統疾病、免疫系統疾病及一些大分子代謝疾病等，全基因雙組學策略不僅可以檢出已知的非編碼區致病突變，還有可能檢出新的致病變異，而且能夠得到變異在轉錄組層面的功能驗證（比如影響調控表達、影響剪切等）。

從檢測模式上看：

這裡說的檢測模式是指先證者模式（即二代測序只測先證者，挑出懷疑變異再做一代驗證），還是核心家系（trio）模式（即二代測序同時檢測先證者和父母）。

對於全外顯子、全基因組如此大的檢測範圍，只檢測先證者是不可取的。

因為先證者模式無法判斷變異是否呈現家系共分離，即便挑幾個懷疑的變異去做家系一代驗證，也很容易挑錯，漏掉真正的致病突變。

先證模式還有一個坑，那就是即便挑了少數變異去做家系驗證，但也無法知道父母樣本是否來自真正的生物學父母，而trios模式則可以藉助大數據比對來判斷生物學父母的可靠性。

trio-WES，或稱核心家系全外顯子組測序，已成為目前遺傳病診斷的基本配置。

在此基礎上再增加核心家系的CNVseq、臨床非編碼區、轉錄組，就分別成為更為強大的增強全外家系、家系准全基因組、家系全基因雙組學策略。

從適用變異形式上看：

遺傳病的基因序列變異主要可以分小（點突變）、中（基因及內部外顯子CNV）、大（100kb以上大片段CNV）這三類。

一般的Panel，臨床外顯子組，甚至全外顯子組，只能檢測小型變異，對中型和大型變異無法檢出，也就是若在Panel範圍內的某個基因及其相關區域存在致病的CNV，會大機率漏檢。

智因的trio-WES，可以利用家系全外顯子數據，對全部約2萬個基因進行外顯子缺失重複的篩查，同時實現小型和中型變異的檢出。

傳統的中型變異檢測方法是MLPA，其局限性是只能檢測指定某一個基因是否存在外顯子缺失重複，而智因全外可以全面掃描幾乎全部2萬個基因的外顯子缺失重複。

如果把MLPA比喻為「狙擊點射」，則智因全外的中型變異篩查則是「地毯式轟炸」。

全外分析對連續兩個以上的外顯子缺失重複的準確性較高，但對單個外顯子拷貝數異常的結果還需MLPA驗證。

智因東方的trio(WES+CNVseq)，或trio(全外+CNV)，或稱家系增強全外，在WES的基礎上，增加了全基因組CNVseq檢測，不僅可以彌補大片段拷貝數變異的檢測，而且還能得到單親二倍體（UPD）的檢出，即可以全面涵蓋大中小三類變異。

CNVseq方法已得到大樣本的驗證，其靈敏度和特異性與CMA晶片無異（參考文獻：ⅰ）。

綜合對比幾種檢測策略：

在這裡，小智來給各位解析表格最右邊兩列：

關於陽性檢出率：

檢測範圍越全，陽性檢出率越高（參考文獻：ⅱ、 ⅲ）。

（註：表格的陽性率只是一個理論值，且僅針對於疑難診斷疾病而言，實際陽性率會受入組患者選擇等因素影響）。

家系trios模式比先證模式更有利於提高陽性檢出率，檢測範圍越大（如全外、全基因組），trios模式的威力就越明顯（參考文獻：ⅳ ）。

關於診斷嚴謹性：

即便檢出了變異，這個變異是否就是患者的病因，基於此的診斷是否靠譜，事關診斷的嚴謹性。

表中幾個因素會對提升診斷嚴謹性：

檢測範圍越全，就越有可能避免局部檢測策略（如Panel）的「一葉障目」的誤診，故診斷就越嚴謹。

家系trios模式，一方面能提供共分離的證據，另一方面還有助於確證家系的血親關係，避免非生物學父母因素導致的烏龍結果，故其診斷會比先證者模式更嚴謹。

轉錄組能提供基因組變異在mRNA層面的功能學證據，故其診斷會比單一的基因組學證據要更嚴謹。

再比較一下這兩個最新策略——家系准全基因組和家系全基因雙組學的區別：

這兩個新策略，都包含trio全外、trioCNVseq、trio-臨床非編碼區測序分析。

與家系准全基因組相比，家系全基因雙組學項目多了trio轉錄組分析。

在臨床非編碼區的分析上，家系准全基因組僅報告已知致病變異，而全基因雙組學則不僅僅報告已知致病變異，而且還能結合轉錄組，對非編碼區變異致病性進行綜合分析。

綜上所述可以看出 家系全基因雙組學策略trio-sWGRs™ 的驚艷之處：

幾近極限的檢測範圍：全外顯子+CNVseq+臨床非編碼區；

大中小變異的全面檢出：

小型變異——點突變的檢測範圍：在已知疾病範圍，全面涵蓋編碼序列和絕大部分非編碼序列，幾乎無死角；

大型結構變異——CNV的檢出： CNVseq可檢出100kb以上的大型拷貝數變異，甚至包括UPD；

中型變異——外顯子缺失重複的檢出：智因trio WES可全面解決中型變異——基因內部外顯子缺失重複的檢測分析；

家系trios模式：可一目了然實現遺傳共分離分析，檢出新發（de novo）變異、嵌合體等；

trio-RNAseq，或稱核心家系轉錄組測序，與DNA的測序策略家系准全基因組聯合，實現基因變異的雙組學解讀：這是基因組之外的另一大組學在遺傳病診斷中的創新應用。

轉錄組可以起到基因組（DNA）測序所不具備的特殊作用：

印證DNA上的變異的真實可靠，並發現DNA上沒有但在RNA上出現的變異，即RNA編輯致病機制。
印證DNA上的預測會影響剪接的變異，是否真正在RNA上體現出異常的剪接體。
印證在DNA的調控區的變異，是否真正影響到RNA的表達。
發現對DNA的NGS測序很難發現的融合、重排等結構變異。

非編碼區雙組學解讀：基於trios策略，和轉錄組的功能學依據，可以根據ACMG評級標準對非編碼區給出生物學及遺傳學的致病性判斷，並且結合臨床特徵，給出綜合致病性解讀。

對於致病基因在白細胞表達並發揮功能的一些疾病，尤其是血液系統疾病、免疫系統疾病及一些大分子代謝疾病等，全基因雙組學策略不僅可以檢出已知的非編碼區致病突變，還有可能檢出新的致病變異，而且能夠得到變異在轉錄組層面的功能驗證（比如影響調控表達、影響剪切等）。

極致檢出率：在除卻特殊機制的情況下，應用家系全基因雙組學策略幾乎可以忽略漏檢的機率。

反過來說，在轉錄組能夠表達的基因中，陰性的結果可以在更大機率上做出正確的排除診斷。

平民價格，貴族服務：當產品的品質達到近乎極致，那唯一要考慮的就是價格了。

目前智因的家系准全基因組，和家系全基因雙組這樣龐大而且高端的「貴族」檢測策略，其檢測分析費用在過去起碼需要十萬元級別，而現在只需要1~2萬元，與業內大多數的trio-WES的價格相當或相近，已經降到了大多數平民百姓家庭能夠承受的範圍，可謂是「平民價格，貴族服務」。

最後敲黑板總結

對於診斷不清的疑難病例：

1. 做Panel不如做全外，價格差不多甚至倒掛；

2. 做全外，就要做trio全外，trio-WES將成為遺傳病診斷的標配。

3. 渴望更高檢出率，則可選擇增強全外、准全基因組、全基因雙組學。

全基因雙組學是目前最高端的「貴族」項目，但卻接近「平民」價格。

4. 這些NGS策略不是萬能的，還有一些變異形式是NGS不能解決的，需要結合疾病診斷的具體需求，增加相應的特殊檢測。

5. 還有一點，表面上看，越高端的項目價格越貴，但從患者的實際診療成本來看，高端項目卻可能是大機率上為患者省錢、省時、降低代價的，相反低端項目卻有可能是花錢多、耗時長、代價高的。