微滴式數字PCR(ddPCR)技術及應用

「預防就是治療」--《眾病之王：癌症傳》

戰勝癌症，早期預防、早期發現是關鍵。

癌症患者如果在晚期被發現，90%的患者都會死亡，而腫瘤在早期發現，5年的存活率是90%。

早期發現惡變細胞蹤跡，可以通過干預手段，提高自身免疫力，也可以完整切除，結合化療，治療疾病。

微滴式數字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）技術，是一種對核酸分子進行絕對定量的方法。

可以對腫瘤早期進行篩查，項目可一次性檢測與腫瘤發生髮展密切相關的 9 個基因 48 個常見突變位點，覆蓋常見惡性腫瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲狀腺癌、結直腸癌、乳腺癌、攝護腺癌、腎癌、膀胱癌、惡性黑色素瘤、腦膠質瘤等。

只需抽取受檢者 4ml 外周血，即可實現腫瘤早期無創檢測。

可以針對性的對高危人群、有腫瘤家族史易感人群、癌前病變人群、疑似腫瘤人群、癌症康復人群進行腫瘤篩查檢測，從分子層面鑑定是否有基因突變，控制癌前病變。

DDPCR的原理是在PCR擴增前對樣品進行微滴化處理，即將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個至數個待檢核酸靶分子。

經PCR擴增後，逐個對每個微滴進行檢測，有螢光信號的微滴判讀為1，沒有螢光信號的微滴判讀為0，根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例即可得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

其靈敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其適用於痕量、不易得到的待檢樣品；彌補了第二代 PCR 系統難以精確測定基因拷貝數、無法對痕量突變定性和定量、精確度低等缺點。

滿足更多臨床檢驗的需求，更精確，更數字化。

非常適合一些稀有樣本中核酸的精確檢測，用於腫瘤的早期篩查、腫瘤繼發性耐藥檢測及腫瘤負荷實時監控等。

微滴式數字PCR的技術優勢

單分子分析：將微量臨床樣本再細分成 2 萬個微滴，實現臨床樣本的「單分子分析」。

真正意義上的絕對定量，可統計突變率：無需標準曲線；檢測下限可低至單拷貝；不依賴ct值，不依賴擴增效率，能克服 PCR 抑制劑的影響。

不再依賴Cq值或內參基因，即可確定低至單拷貝待檢靶分子的絕對數目。

（Cq值：PCR擴增過程中，擴增產物（螢光信號）到達閾值（進入指數增長期）所經過的擴增循環次數）。

數據分析自動化：每個微滴的檢測結果以陰性、陽性標示，由設備直接判斷，通過把樣本稀釋成許多部分，然後在一個反應發生的時候對其計數。

靈敏度可高達0.001%,顯著高於擴增阻滯突變系統（0.1%）和sanger法測序（10%）。

克服了傳統PCR系統高成本、通量有限、流程複雜、精確度低等缺點。

使用靈活：可按實驗需要調整通量和靈敏度。

微滴式數字PCR的應用

定量癌症標誌物

與野生型DNA的背景下，癌症相關突變因濃度低，往往逃過檢測。

微滴式數字PCR系統以其高靈敏度，能夠輕鬆定量低至0.0001%的突變，這是其他方法無法做到的。

區分基因組變異

拷貝數變異（CNV）是人類基因組中個體差異的一個重要來源。

CNV與癌症、神經和自身免疫疾病以及藥物的不良反應存在關聯。

可靠地鑑定此類CNV，也代表了前沿研究中一種重要的能力。

研究病毒載量

在確定疾病狀態和開發有效療法時，精確地定量病毒載量至關重要。

病毒庫不斷波動，有時會降至極低的水平。

在研究許多不同的病原體時，成功和失敗之間也許就一步之遙，那就是能夠準確重複地測定病毒DNA或RNA。

之前，美國密西西比州一名出生時攜帶愛滋病毒的嬰兒，經過抗逆轉錄病毒的治療，已經被「功能性治癒」。

在這個案例中，ddPCR平台發揮了重要的作用。

研究人員表示，它通過將樣品隨機分布在上萬個微滴中進行PCR擴增，從而確保了高度靈敏而準確的HIV DNA低拷貝分析。

新一代測序的驗證

美國福瑞德•哈金森癌症研究中心的研究人員去年在《BioTechniques》雜誌上發表文章，稱ddPCR可作為一種精確的方法，用於NGS文庫的質量控制。

在新一代測序的樣品製備中，準確定量測序文庫很關鍵，這可保證測序平台的高效利用。

若測序運行時的文庫分子過多或過少，都會使數據質量受損，有時甚至沒有數據。

這不僅浪費寶貴的樣品和試劑，也浪費用戶和儀器的時間。

ddPCR系統可以融入NGS的文庫製備流程中，精確定量測序文庫。

基因表達分析

準確定量樣品中存在的RNA轉錄本，有助於更好地了解基因表達和調控。

ddPCR系統以其高靈敏度，特別適合發現和定量稀有轉錄本，讓研究人員更深入地探究單細胞轉錄組學，並更好地了解RNA的實際功能。

同時，其高精確度也使其能夠檢測樣品之間基因表達的微小變化。

去年發表在《Nature Methods》上的一篇文章稱，ddPCR技術能在不同情況下，準確重複地定量血漿和血清中的microRNA。

作者認為ddPCR能幫助我們更加精確地追蹤病人在治療期間不同時間段中的血清microRNA濃度變化情況，這對於實時PCR來說，有時是不可能實現的。

總體來說，ddPCR的優點就是能夠準確靈敏地檢測出微量基因的變化及差異，提供給我們更可靠的數據，尤其是在臨床醫學研究領域其作用非常重要。

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