從「爆菊」到糞便基因研究-腸癌篩查技術發展簡史

腸癌發病形勢嚴峻，但同時，腸癌也是「最容易防治的癌症」之一。

美國國家癌症研究所數據表明：「腸癌從增生到晚期，通常要經歷10年左右的發展期。

越靠近晚期，治療生存率就越低。

早期的小腺瘤症狀不明顯，一經發現，完全可以直接切除，即使是I期的腺癌，只要發現及時，生存率也高達95%。

但大多數患者發現時已經是晚期（III期、IV期）了，IV期的5年生存率只有5%。

」

因此，腸癌的早篩查、早發現至關重要。

由於技術手段的限制，古代對腸癌沒有形成有效的篩查和治療方法。

到了近代內窺鏡的出現，才開始實現對腸癌的有效篩查。

下面，我們就來回顧一下主要的腸癌篩查手段，看看相比那些「古老」的篩查手段，現在醫學的發展都給我們帶來了什麼最新的腸癌篩查方式。

18世紀初-20世紀：「爆菊」的開始——內窺鏡誕生

德國科學家Bozzini發明了第一款用於直腸檢查內窺鏡。

由於是用硬質管做成的，體驗效果很差，得不到廣泛的應用。

1965年內窺鏡用軟質管製作，開啟了「纖維內窺鏡」時代，擴大了對於下消化道疾病的檢查範圍。

但是，不管內窺鏡如何發展，它的弊端也是顯而易見：痛苦大、侵入性強，在腸鏡進入的過程中有可能因為操作不當而引發消化道出血、穿孔。

因此，為解決「爆菊花」的問題，科學家又開始尋找全新無創的腸癌篩查方法。

20世紀80年代：無創方法開始建立

免疫膠體金便隱血試驗

免疫膠體金便隱血試驗通過檢測糞便中血紅蛋白含量來判斷結直腸癌風險，在腸癌及腸癌高風險人群的篩檢方面有重要價值。

但是由於結直腸癌症狀較隱匿，缺乏特異的臨床表現，可能出現因暫停出血或腫瘤早期無出血症狀造成的漏診，靈敏度較差。

90年代-至今

精準無創時代真正到來

隨著基因檢測技術的飛速發展，從90年代至今，腸癌篩查技術進入了突飛猛進的發展時期。

雖然腸鏡檢查仍然是無可動搖的金標準，但由於腸鏡篩查的痛苦，早期腸癌和癌前病變往往是沒有症狀的，並且一旦出現症狀再去進行檢查，往往已經是晚期，治療難度大大增加。

因此，無創的腸癌篩查方式非常必要，這能夠很好的提高患者依從性，提高腸癌的預防率，減少腸鏡篩查帶來的痛苦以及不必要的風險。

目前，無創的腸癌篩查技術主要包括了PCR檢測和高通量測序，檢查的樣本類型包括了血液和糞便兩種。

PCR檢測——生物標誌物

血液中DNA檢測：檢測血液結直腸癌細胞中SEPT9基因高度甲基化，是結直腸癌變特異性標誌物之一，而正常組織中不會出現。

2015年《中國早期結直腸癌篩查及內鏡診治指南》已將「血液SEPT9 DNA甲基化檢測（mSEPT9）」納入早期結直腸癌低危人群篩流程，但尚缺乏相關獲益的研究數據。

在2017年最新的美國結直腸癌篩查指南中不建議血液查SEPT9檢測作為常規的結腸癌篩查手段。

目前公布的數據來看：血液中SEPT9 DNA甲基化檢測對結直腸癌檢出率的敏感性為68%，特異性為80%[1]。

糞便DNA PCR檢測：該技術優勢在於無創無痛苦，可以居家取樣，同時qPCR（螢光定量PCR）技術具有儀器設備價格低廉的優勢。

但局限在於檢測多個樣本、多個突變位點時操作繁瑣，且只能針對特定的位點設計方案，不能進行未知突變的篩查。

並且該技術精度有限，易造成檢測結果的假陰性或假陽性。

此外，由於技術手段的限制，突變檢測精度只能達到1%，也就是說，100個細胞中有一個腫瘤細胞可以被檢出，而對於1000個細胞中有一個腫瘤細胞的低頻突變則無能為力了。

2014年由美國Exact Sciences公司研發的Cologuard®利用qPCR技術已獲得美國食品藥品監督管理局（FDA）批准臨床使用，成為首個被美國FDA批准的非侵入性結直腸癌篩查試劑盒[2]。

同年相關數據已發表在《新英格蘭醫學雜誌》（NEJM）上，結果顯示通過分析糞便DNA和便隱血來篩查結直腸癌可以獲得前所未有的癌前病變和腫瘤的檢出率。

Cologuard®通過qPCR檢測糞便中分子標誌物以及便隱血檢測實現結直腸癌早期診斷。

2017年在美國已做57萬例，預計2018年將會超過100萬例。

高通量測序技術檢測糞便中脫落腫瘤細胞DNA

高通量測序技術又稱「下一代」測序技術(Next Generation Sequencing,簡稱NGS)，以能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定為標誌，具有速度快、準確率高、通量高等優點。

高通量測序用於結直腸癌早期篩查，有如下優勢：

1）更多的基因檢測靶標和檢測內容：包括更多的檢測位點和更多的基因變異/修飾類型的檢測；對於癌症發生髮展這樣涉及多個基因，多種機制的複雜疾病，必然要求對相關的基因位點及具體變異形式進行全面的檢測和分析。

而且除點突變之外，移碼，缺失，融合等多種變異形式可以通過NGS方便測出，更進一步，一些與癌症病理相關但非基因編碼水平變異的表觀遺傳學修飾也能利用NGS技術平台進行更好地判讀。

2）NGS結果的高信息量有助於生成更合理的判讀算法或模型：例如KRAS檢測通常包含的7種突變類型在美國的腫瘤資料庫中顯示為頻率最高的類型，但是在中國人群中會有不同的分布差異，通過深度測序積累的數據量，可以達到優化或重新定義中國人群KRAS突變檢測位點的權重的目的，有助於大數據量下的機器學習方式來進行算法開發，滿足技術研發的自我升級；而傳統檢測技術，固化的檢測內容，對於判讀優化的效率不高。

3)NGS方法可以實現更高的靈敏度，實現對痕量變異/修飾基因的檢測：通過建庫方法的優化，效率的提升，測序深度的增加，特異編碼的識別，以及NGS技術平台本身性能的發展，NGS可以檢測到樣本中含量非常稀少的變異/修飾基因，而PCR往往對檢測比例百分之一以下的突變基因無能為力；因此NGS有助於對樣本內基因的真實變異/修飾情況形成更真實客觀的評價。

國內已經有公司利用高通量檢測技術開發了早期腸癌篩查產品，敏感性和特異性均達到90%以上。

其他無創篩查相關技術

腸道菌群：近年利用糞便菌群的檢測來評估腸癌發生髮展越來越受重視和關注。

研究學者發現通過宏基因組高通量測序分析結直腸癌患者、腺瘤及正常人的糞便菌群樣本，構建基於菌群的結直腸癌診斷模型也具有較好的診斷效果[1]，但目前該手段僅處於研究階段，要將這些研究結果用於臨床仍需要克服一些困難，如研究的樣本量、研究的技術、統計學的方法、診斷試驗的局限性等。

microRNA(miRNA)：miRNA是一類具有調控作用的單鏈小分子RNA，與腫瘤的增殖、侵襲和轉移有很大的關係。

結直腸癌作為一種常見的消化道腫瘤，與miRNA有密切的關係。

miRNA的出現為結直腸的早期篩查提供了新的思路[4]，但miRNA在糞便中穩定性差，目前該手段僅處於研究階段。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)：LncRNA的異常表達與腫瘤的發生髮展、侵襲、轉移等過程密切相關。

結直腸癌相關 LncRNA相繼被發現，均不同程度地影響腫瘤的發生髮展、轉移及預後。

但是，其中僅有少數 LncRNA 的作用機制被闡明，人們對其他 LncRNA 調控結直腸癌的分子機制了解甚少，它們在結直腸癌發生髮展中有無協同作用， 在其他腫瘤中表達水平如何，以及怎樣將 LncRNA 應用於臨床尚待進一步研究。

相信在不久的將來，具有細胞和組織特異性的 LncRNA 有望成為一類全新的結直腸癌診斷分子標記物和新藥治療靶點標記物[5] 。

循環腫瘤細胞(CTCs)及循環腫瘤DNA(ctDNA)：對結直腸癌的早期診斷、療效監測、預後評估以及個體化治療方案制定均有重要意義，已成為近年來研究的熱點。

CTCs 是一種可通過外周血檢測的從實體瘤脫落入血液循環可引起腫瘤轉移的具有腫瘤特異性抗原或基因特徵的腫瘤細胞 。

ctDNA是一種無細胞狀態的胞外 DNA，屬於游離 DNA 的一部分，主要來源於腫瘤細胞的壞死或凋亡、微轉移灶或 CTCs 的裂解和增殖旺盛腫瘤細胞的釋放。

CTCs和ctDNA可以輔助早期診斷及良惡性判斷、指導分期及分子分型、篩選藥物及監測療效、提示微轉移及預後等，且非侵入性，可以多次便捷取樣實現實時監測，被稱為「液體活檢」。

隨著分子診斷技術的發展，通過檢測CTCs和ctDNA的基因突變和表觀遺傳變異如DNA甲基化將成為檢測腸癌的下一代方法。

但CTCs和ctDNA 在腸癌早期診斷中的價值尚需要進一步的深入研究和大規模樣本的數據支持[6]。

鑒於目前其他腸癌早篩技術的發展不成熟，僅僅停留在學術研究階段，還需要更多權威的研究。

相比較而言，基於高通量測序技術檢測糞便DNA來篩查結直腸癌的產品可以期待在市場上得到更多的認可。

高通量測序技術在臨床醫學上展望

隨著測序成本的不斷降低，高通量測序技術在生命科學及醫學領域方面的研究和應用越來越廣泛，分析與挖掘測序得到的基因組大數據，提煉出與疾病相關的遺傳變異信息，可以為疾病的診斷、治療和預防提供科學依據。

高通量測序技術在臨床醫療中正在發揮著不可替代的作用，是推動精準醫學發展的關鍵技術之一。

2013年11月，美國FDA審批通過MiSeqDx測序儀及配套試劑盒用於臨床測試[7]，這是高通量測序技術獲得臨床認證許可的標誌性事件。

隨後，FDA緊鑼密鼓地加速高通量測序技術在臨床腫瘤診斷中應用。

2017年11月FDA正式宣布批准紀念斯隆凱特林癌症研究中心基於NGS技術的癌症基因檢測分析平台MSK-IMPACT™。

通過這款產品可以詳細全面檢測癌症患者468個腫瘤基因突變情況,適用於任何腫瘤類型檢測[8]。

短短半個月後，FDA宣布批准Foundation Medicine公司基於NGS技術的檢測產品FoundationOne CDx (F1CDx)用於腫瘤臨床診斷。

F1CDx可診斷出包括結直腸癌在內的多種實體瘤，如非小細胞肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌等[9]。

2014 年 6 月 30 日，經國家食品藥品監督管理總局(CFDA)審查，批准了華大基因BGISEQ-1000基因測序儀和BGISEQ-100基因測序儀的醫療器械註冊。

這是CFDA首次批准註冊的第二代基因測序診斷產品，標誌著我國生物技術領域基因測序關鍵技術的重大突破。

2015年3月31日，CFDA再次批准了高通量基因測序儀（NextSeqCN500）以及無創產前檢測胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）的試劑盒的醫療器械產品註冊和上市。

這些審批的通過，說明國內外政府機構已充分認識到精準醫學是提高醫療健康水平的需要，也是現代醫學發展的方向。

FDA批准高通量測序腫瘤基因檢測大panel對國內的監管政策也會產生巨大的影響，將會改變CFDA對高通量測序在腫瘤基因檢測上的謹慎態度，變得更加積極和開放。

過去與腸道抗爭的痛苦時代已一去不復返，高通量測序技術也將作為腸癌的篩查利器而造福人類。