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參、針對應用硫代乙醯胺誘導肝纖維化之慢性肝損傷 一、 前言        　　在1950年代即有以硫代乙醯胺（thioacetamide, TAA）餵飼大鼠誘導肝損傷之報告，而且TAA在大（小）鼠所誘導肝損傷之病理變化類似人類的肝損傷病變，因此，得以TAA誘導肝纖維化作為化學性肝損傷動物模式。

     　　TAA是一種可以用不同方式造成急性或慢性肝損傷的選擇性毒性物質，所造成的病變處於肝臟的小葉中心，這與許多毒性物質在人所造成的肝損傷區域相同。

另外，並非TAA本身直接造成之肝損傷，而是因其在體內的代謝產物攻擊肝臟所造成。

使用TAA的優點有很多，如TAA因其半衰期短，所以可以很快造成急性的肝臟毒性，但是TAA所造成的急性致死性與一些較傳統之肝毒性物質如：四氯化碳、乙醯胺基苯酚和三氯甲烷有所區別，TAA從給予動物到致死約有3.5到7天的時間，可以觀察肝細胞壞死到肝衰竭死亡的病變過程，而其他較傳統之肝毒性物質，若是給予致死劑量，則在12～24小時左右的時間即會造成動物死亡，因此不利觀察。

       　　此外，TAA具有高度肝特異性的毒性，除非在一超高之劑量才會也造成腎臟傷害，否則TAA僅會造成肝臟損傷。

TAA進入動物體中經由混合功能氧化酶系統（mixed functionoxidasesystem）可代謝產生acetamide與TAA-S-oxide（圖一），TAA-S-oxide再經由cytochrome P450monoxygenase轉變為一具高活性化學物質TAA-S-dioxide，TAA-S-dioxide會與組織大分子作共價鍵結，進而破壞肝細胞，並造成氧化壓力（oxidative stress）與肝壞死。

因氧化壓力造成肝星狀細胞活化與形態改變，這些活化和形態改變包括有促進增生之能力、促進生成和降解細胞外基質、促進化學趨向性與促發炎的能力，最後若TAA所造成的肝細胞壞死持續進行，則會演變成肝纖維化，甚至出現節結。

圖一　TAA在肝臟的代謝路徑          　　研究指出，給予SD大鼠不同劑量（50, 150,300或600 mg/kgbw）之TAA，之後於0～96小時內觀察其肝損傷與修復之情況，他們以血清中ALT之濃度判斷肝損傷程度，發現前3個較小劑量（50, 150, 300mg/kg）之肝損傷程度並沒有劑量上的差異，而且老鼠也不會死亡。

給予 600 mg/kg的老鼠一開始，其肝損傷之程度反而明顯低於其他三組，但隨時間之增加（>48小時），給予 600 mg/kg的老鼠其肝損傷程度也隨之增加，而且給予 600 mg/kg的老鼠死亡率達90%。

另外1995年也有報導指出TAA所造成血清學中脂肪酸變化與肝硬化病人相似，皆會因肝臟合成脂肪酸能力下降而造成血清中脂肪酸含量減少。

       　　TAA造成肝損傷於1951年即有學者研究，至今已有許多TAA誘導不同肝損傷之動物研究，其中有極大部分是用以評估預防或治療肝損傷之討論，因此以TAA誘導肝損傷用以評估健康食品之護肝功能是極為有效之方法。

二、 實驗項目與實驗方法 (一) 執行單位與執行人：         　　本評估試驗原則上應委託具有充分設備之國內外大學食品、營養、醫藥等相關研究所、教學醫院以上之醫療機構或具公信力之研究機構執行，以維持客觀與可靠性。

試驗計畫主持人必須具備足夠與肝臟生理代謝相關之專業背景與研究經驗或著作；試驗必須事先經過執行單位之動物試驗委員會審查通過。

(二) 實驗設計：         　　建議實驗動物採用雄性SD或Wistar大鼠，起始體重約 250克 ，每組至少8隻。

動物必須來自公立研究機構、公私立大學或其他中央衛生主管機關認可之實驗動物中心。

動物之飼養宜在恆溫（22±2℃）、亮暗各12小時之動物房。

飼養或處理時應避免動物驚嚇，且每次必須前後一致，避免誤差值過大。

本評估試驗之實驗組別應包括1.正常對照組：攝取正常飲食；2.負控制組：動物給予TAA處理，攝取正常飲食；3.試驗組：動物給予與負控制組完全相同之TAA處理，並分別於飼料中另給予2種以上劑量之試驗樣品，其中一組的劑量必須相當於人體的建議攝取量，且於TAA誘導肝損傷前一星期即開始給予試驗樣品。

試驗原始數據紀錄必須保留供查核。

１、 試驗方法：        　　採用TAA誘導大鼠產生慢性肝損傷實驗模式，本方法中之TAA使用劑量僅供參考。

實驗前將大鼠依體重以逢機法平均分配至各組，動物至少分成4組，每組至少8隻： (１) A組為正常對照組：腹腔（intraperitoneal, I.P.）注射生理食鹽水＋經口（peroral,peros, P.O.）管餵去離子水； (２) B組為負控制組（肝損傷組）：100 mgTAA/kgbw（I.P.）＋去離子水（P.O.）； (３) 試驗組至少2組（C、D組），視實驗設計需要可再增加組別：100 mgTAA/kgbw（I.P.）＋2種以上不同劑量之試驗樣品（P.O.），其中之一劑量須與換算的人類建議攝取量相同。

２、 試驗步驟：        　　A組腹腔注射 0.5 mL生理食鹽水，B～D組腹腔注射100 mgTAA/kgbw（0.5 mL/ 30g bw），每週3次（可分別在週1、週3及週5注射），於肝炎誘導1小時後管餵試驗樣品，以減少藥物與樣品互相影響。

A、B組每日管餵0.5 mL去離子水；C、D組則於TAA誘導肝損傷前1星期開始每日給予試驗樣品（前後共為期9週）。

       　　所有實驗動物於TAA誘導肝損傷開始的前1週、第0週、第1、3、6週進行採血，採血前24小時禁食，並於投予試驗樣品或去離子水後4小時，以尾部採血方式檢測肝臟的生化功能：AST（GOT）、ALT（GPT）、三酸甘油酯（TG）、膽固醇（cholesterol）、白蛋白。

最後於TAA誘導肝損傷第8週結束時，秤重後全部犧牲，從心臟或腹大動脈採血檢驗肝臟生化功能，並剖腹取肝臟標本，秤重後將最大右葉肝割取2-3塊 1公分 見方之組織塊，固定於10%的中性福馬林（formalin）液中，再以石蠟包埋、切片、貼附在載玻片上後，分別進行蘇木紫－伊紅染色（haematoxylin-eosin stain,H&Estain）、膠原纖維的特殊染色，如Masson’s trichrome染色或其他適合之染色方法來進行病理學觀察。

３、 實驗動物與人體間試驗劑量之換算：        　　以管灌（gavage feeding）方式給予受試樣品時，一般的認知，身體的新陳代謝速率與其體表面積的相關性，明顯超過與其體重之相關性。

然而，要精確測量其體表乃非常不易，而即使在同一物種（species）內之體表，其與體重間並沒有一簡單正確的公式可換算，且其關係又會隨著體重和體型的改變而與體表之關係係數呈現不規則的變異，因此在實驗期間之試驗劑量要維持與其代謝率之固定相關性；或人體與動物間之試驗劑量要精確的換算有其實際的困難。

       　　本評估方法的人體與高等實驗動物間試驗劑量間之換算，原則上根據2005年美國食品藥物管理局所公告之實驗初期估算方法（Estimating themaximumsafestartingdoseininitialclinical trialsfortherapeuticsinadulthealthyvolunteers），而以60公斤之成人為基準。

使用高等實驗動物進行試驗時，其劑量之換算原則上以人體每日每公斤體重之建議攝取量（/kg bw/d）的6.2倍作為大鼠之1倍劑量，其他動物或更詳細的換算可參閱該方法http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm078932.pdf另換算之。

本換算方法適用於根據每天每隻動物之個別體重變異而換算出應給予直接管灌之試驗樣品劑量。

此劑量換算方法提供業界參考，非強制性依據，但使用其他換算方法時，應附其明確之資料來源。

(三) 實驗測定項目：         　　在進行相關成分測定時，可參考以下建議之方法，亦得使用有學理根據之適當方法或具公信之市售套組進行分析。

１、 血清或血漿：測定與肝傷害相關之成分或酵素活性 (１) AST(GOT) (２) ALT(GPT) (３) TG (４) 膽固醇 (５) 白蛋白         　　所採之大鼠血液樣品在室溫下放置約1小時，使其凝結，再利用冷凍離心機於 4℃ 下，以14,000 ×g離心5分鐘，分離出血清。

再以血液自動生化分析儀檢測肝功能生化指數，包括AST（GOT）、ALT（GPT）、TG、膽固醇等，其中AST（GOT）及ALT（GPT）檢測原理是依據Reitman與Frankel（1957）及國際聯邦臨床化學（IFCC, 1986）的標準方法。

另必須測定肝重／體重（%）等指標。

(四) 組織病理切片觀察：         　　在8星期試驗期結束時，將所有大鼠均予以犧牲，採血後，將最大右葉肝臟割取約 1公分 見方的組織塊，放入10%的中性福馬林中固定，，做進一步的病理切片與染色。

進行H&E染色，以觀察肝細胞的受損、壞死、纖維化等慢性肝損傷變化，並進行膠原蛋白的特殊染色，例如Masson’s trichrome染色或其他適合之染色方法，以便評估纖維化程度。

        　　肝炎與肝硬化的評估可依國際通用的肝炎組織學活動性指數（histology activityindex,HAIscore）分析，把肝炎活性依門脈區，門脈周邊，及肝小葉區各別分析，給予0～10分的評估分數，其總和代表肝炎活性（表一）。

肝纖維化則依Metavir score分為5級（圖二），包括：F0：沒有肝纖維化，F1：門脈纖維化，F2：少量纖維間壁，F3：許多纖維間壁，F4：肝硬化。

為了避免觀察時主觀上的偏差，所有的組織病理切片都由最大右葉肝的同一位置切取下來，進行病理染色。

至於病理的半定量分析之評估，則應由獸醫病理醫師，在不清楚本實驗設計的情況下進行單盲判讀，對所有切片進行評分比較，最後再以統計分析方法進行各組差異性的分析。

病理切片之照片應提供高解析度之彩色圖檔；照片應統一以中央靜脈（central vein,CV）或門靜脈（portal vein,PV）為中心拍照，若為各組之間的比較，顯微鏡的放大倍率須一致。

表一　肝炎組織學活動性指數 　 　 圖二　Metavirescore分析肝纖維化。

F0：沒有肝纖維化，F1：門脈纖維化， F2：少量纖維間壁，F3：許多纖維間壁，F4：肝硬化。

　 １、 組織包埋和切片        　　將最大右葉肝割取的約l公分見方的組織塊，置入10%的中性福馬林中固定其組織形態及結構，接著以不同濃度之乙醇（30、50、70、95、99.5%）與二甲苯（xylene）進行脫水與透明化步驟，再以熱石臘溶液取代二甲苯，最後將組織以石蠟溶液進行包埋。

完成的石蠟標本利用切片機切成5 μm的連續石蠟切片，將切下來的切片沾黏在乾淨的載玻片上，於37°C烘乾後可做進一步的病理染色。

２、 蘇木紫－伊紅（haematoxylin-eosin, H&E）染色法        　　將肝臟組織切片置入二甲苯30分鐘脫蠟，再依序置於99.5、95、70、50及30%之乙醇各30分鐘以進行復水，最後浸泡於蒸餾水10分鐘後即可進行染色。

首先浸泡蘇木紫30秒染細胞核，再用蒸餾水清洗數分鐘，接著使用伊紅染色2-5分鐘，再用蒸餾水清洗數分鐘。

完成染色過程後進行脫水步驟，依序放置於50、70、95及100%乙醇各2次，每次30秒，再以二甲苯進行透明化2次，最後以蓋玻片封存。

３、 Masson’strichrome染色法        　　切片先經二甲苯的脫臘和乙醇復水後，將處理過的切片放在Bouin氏溶液中固定7分鐘，然後水洗約10分鐘至切片上黃色消失，再將切片以Weigert's ironhematoxylin溶液染色10分鐘，用溫的流水洗10分鐘，再用蒸餾水稍沖洗切片；再以Biebrich scarlet-acid fuchsinsolution染7分鐘，用蒸餾水稍沖洗切片，用phosphomolybdic-phosphotungstic acid solution染5分鐘，用蒸餾水稍沖洗，再用aniline bluesolution染5分鐘，以作對比染色，用蒸餾水再稍沖洗之，置於1% aceticacidsolution染3分鐘，後用蒸餾水稍沖洗切片。

完成染色過程後進行脫水步驟，依序放置於50%乙醇中30秒、70%乙醇中30秒、95%乙醇中20秒、100%乙醇中20秒、100%乙醇中30秒，再用二甲苯進行透明化2次，最後以蓋玻片封存。

４、 Gomori網狀纖維染色法 (１) 試劑的配製：         　　取10%硝酸銀3份，加入10%的氫氧化鉀1份，混合後產生大量的黑色沉澱物，倒去表面的液體，保留下沉澱物，加入0-20倍或更多的蒸餾水進行沖洗，連續沖洗3次。

待沉澱物清晰則可。

用濃氨水逐滴加到溶液中。

使沉澱物逐步溶解。

待見沉澱物剩少數幾顆時，再取10%的硝酸銀液加入數滴，至溶液再現渾濁為止。

再用氨水將其溶解，然後稀釋10-15倍，即可使用。

平時保存於 4℃ 冰箱中。

(２) 操作步驟：         　　首先將切片脫蠟，以蒸餾水沖洗後，用0.5%高錳酸鉀溶液氧化5分鐘，再以自來水沖洗，繼用蒸餾水洗，用2%草酸漂白切片2分鐘，自來水洗，蒸餾水洗，接著用2%硫酸鐵銨媒染5分鐘，水洗，蒸餾水洗，滴入氨性銀溶液浸染3-5分鐘，蒸餾水洗數次，再以10%甲醛液還原5-10分鐘，水洗2分鐘，用核固紅染色10-15分鐘，水洗10分鐘後，以不同級酒精與二甲苯逐次脫水，最後以中性樹膠封片。

此染色法結果會顯示網狀纖維為黑色，膠原纖維為黃棕色，而核為紅色。

(五) 肝臟膠原蛋白的定量：         　　因為每7.46克膠原蛋白中含有1克之hydroxyproline，因此測量hydroxyproline的含量，即可求得膠原蛋白試樣的原始濃度。

先以chloramine T將hydroxyproline氧化成pyrrole，並進一步與Erlich's reagent反應呈色，藉由分析試樣中hydroxyproline含量即可推算試樣中膠原蛋白的含量。

首先將hydroxyproline酸解，使樣品最後溶於6N HCl，並置於長玻璃管中，於 110℃ 恆溫烘箱中反應24小時，室溫下冷卻後，將長玻璃管蓋子打開，進行真空乾燥，約需時5-7天，待試樣完全乾燥，加入citric phosphatebuffer回溶後，分裝於96孔免疫酵素分析測定盤（96 wellELISAplate）中，於 55℃ 烘箱中反應60分鐘。

再將待測試樣及不同濃度的標準液各取80 μL加入96孔免疫酵素分析測定盤中，再加入125 μLchloramineTsolution，室溫下混合均勻後，靜置反應20分鐘，在每個孔中加入Erlich's reagent125μL，混合均勻後，以矽膠片包覆96孔免疫酵素分析測定盤並固定之。

在 75℃ 水浴槽中反應16分鐘後，小心取出測定盤，迅速置入冰水浴中5秒鐘，將盤外冰水拭去，立刻移至自動免疫酵素分析儀（ELISA reader），測定550 nm吸光值。

以所測得標準液的吸光值對濃度作標準曲線後反推計算試樣中hydroxyproline濃度。

        　　　　膠原蛋白濃度＝ Hydroxyproline濃度× 7.46。

(六) 實驗數據統計分析：         　　選擇適當的生物統計方法分析，比較試驗組於試驗前、後上述各指標值（即試驗的起始值、結束值）之結果變化，以及試驗組與正常對照組及負控制組間的比較是否具統計上之顯著改善（p＜0.05）。

本評估方法必須進行組間的統計比較，例如先以ANOVA（analysis ofvariance）比較，有明顯差異時，再以Duncan's multiplerangetest同時比較各組別間之差異，以評估該試驗樣品的最適劑量，以及相對於正常對照組及負控制組該試驗樣品是否具有明確的改善功效。

然後加以綜合判斷該試驗樣品是否具有保護肝臟或可降低其中某項危險因子之功能。

        　　選擇適當的生物統計方法分析，比較試驗組於試驗前、後上述各指標值（即試驗的起始值、結束值）之變化結果，以及試驗組與正常對照組及負控制組間的比較是否具統計上之顯著改善（p＜0.05）。

本評估方法必須進行組間的統計比較分析，例如先以ANOVA（analysis ofvariance）比較，有明顯差異時，再以Duncan's multiplerangetest同時比較各組別間之差異，以評估該試驗樣品的最適劑量，以及該試驗樣品與正常對照組及負控制組間的功效比較。

然後加以綜合判斷該試驗樣品是否具有保護肝臟或可降低其中某項危險因子之功能。

三、評估方法之測定項目原則 (一) 血清或血漿：測定與肝傷害相關之成分或酵素活性         必測：AST (GOT)、ALT (GPT)         選測：TG、膽固醇、白蛋白 (二) 病理切片觀察        必測：H&E染色         且下列二染色法選一必測： １、Masson’s trichrome染色法 ２、Gomori網狀纖維染色法 (三) 肝臟組織         選測：肝臟膠原蛋白（collagen）定量分析 (四) 必測：記錄慢性實驗期間動物每週體重、肝重／體重（%）、死亡率及其他相關之測定項目。

(五) 得增加測定其他適當的肝纖維化指標，例如MMP-2、TIMP-1等項目。

四、 結果判定之基準        　　由以上血清與肝臟之各項測定值、病理切片觀察結果，並加上其他相關測定項目之數據，經統計分析後所得之客觀結果，加以綜合評估判斷。

五、 宣稱、廣告與產品標示        　　受試產品進行以本評估方法推薦之試驗方法，且獲得明確之有效結果時，得向中央衛生主管機關申請與實驗結果相符的宣稱、廣告或產品介紹，例如僅降低ALT或AST者，不得廣泛宣稱能預防或改善肝纖維化，或誤導以為亦可改善肝硬化或肝癌之功效。

凡能降低血清ALT、AST及減少組織切片肝纖維化狀況的產品，得宣稱、廣告或介紹「經動物實驗，攝取本產品可預防或改善硫代乙醯胺誘導之肝纖維化或降低其危險因子」或其他相近具科學依據的詞句。

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