黃體生成激素與動情素共同作用下對於內皮細胞遷移的影響

論文名稱(英文), Effect of combined estrogen and progesterone treatment on vascular endothelial cell migration ... 中文關鍵字, 黃體素；動情激素；遷移. 英文 ... 進階搜尋 學院別 >臺北醫學大學 >醫學院 >醫學科學研究所   查詢北醫館藏 系統識別號 U0007-2607201317292900 論文名稱(中文) 黃體生成激素與動情素共同作用下對於內皮細胞遷移的影響 論文名稱(英文) Effectofcombinedestrogenandprogesteronetreatment onvascularendothelialcellmigration 校院名稱 臺北醫學大學 系所名稱(中) 醫學科學研究所 系所名稱(英) GraduateInstituteofMedicalSciences 學年度 101 學期 2 出版年 102 研究生(中文) 林正哲 研究生(英文) Jhen-JheLin 學號 M120099056 學位類別 碩士 語文別 中文 口試日期 2013-06-28 論文頁數 65頁 口試委員 委員-許勤委員-蕭哲志指導教授-李文森 中文關鍵字 黃體素；動情激素；遷移  英文關鍵字 Progesterone  Estrogen  migration  學科別分類 中文摘要 有關女性荷爾蒙對血管增生的影響，過去已有相關的文獻報導，並且從女性的月經週期的荷爾蒙分泌情形我們推測雌性素(E2)及黃體素(P4)會彼此交互作用而去影響到血管增生的現象。

在本實驗室先前的細胞培養研究中指出單獨處以E2(3-300nM)或是黃體素P4(5-500nM)有明顯地抑制臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的遷移能力，且此抑制作用與投予的荷爾蒙濃度呈正相關。

然而這樣的研究結果與過去文獻報導中所指出E2及P4在體內對於血管增生的影響並不一致。

因此本研究的目的是想利用細胞培養方法來釐清P4和E2他們單獨對於血管內皮細胞的遷移作用是否有與其在活體內有其他促進或是抑制血管增生因子存在下有相同的影響，以及他們相互間是否會彼此影響其對內皮細胞的遷移作用，並利用細胞分子生物學的技術來探討這些相互影響的作用分子機轉。

利用woundhealingassay和Transwellsassay的實驗結果得知，E2在1nM的濃度下對於HUVEC的遷移能力並無明顯的影響，然而在單獨投予50nM的P4或同時投於E2(1nM)與P4(50nM)則對HUVEC的遷移能力有顯著地抑制作用。

給予這些濃度下的E2或P4都不會影響HUVEC的存活率、對細胞外間質的貼附能力及MMPs的活性。

利用Westernblot的技術來分析時，我們發現在單獨給予P4或同時給予E2和P4會促進cSrc的磷酸化，並使RhoA的表現量減少。

然而事先給予PP2抑制劑(400nM)去阻斷cSrc之後，則P4及E2+P4對於HUVEC的遷移抑制作用則消失，顯示P4可能是透過活化cSrc而造成HUVEC遷移的抑制作用。

我們利用在細胞培養液中加入血管增生促進因子VEGF來模擬在子宮內膜的invivo情況，而發現在給予VEGF(5ng/mL)下，HUVEC移動能力會增加，然而同時給予VEGF及P4時，VEGF所引起的內皮細胞遷移的促進作用則消失。

意外的，我們發現在同時投予VEGF、E2及P4時，則P4對於VEGF的影響又不見了，顯示E2、P4及VEGF三者間對於血管增生有著某種相互的影響。

英文摘要 Theeffectoffemalesexhormonesonangiogenesishasbeenpreviouslyreported.Accordingtotheconcentrationprofileoffemalesexhormonesduringmenstrualcycle,itisreasonabletospeculatethatestrogenandprogesteronemightinteractandregulatetheangiogenesisprocess.Previously,wedemonstratedthattreatmentwithE2(3-300nM)orP4(5-500nM)alonecouldsignificantlysuppressHUVECmigrationabilityinaconcentration-dependentmanner.However,thesefindingsdifferfromthepreviousreportsfrominvivostudies.Accordingly,theaimofthisthesisresearchwastoclarifywhetherE2andP4alonehasthesameeffectinvitroandinvivoontheendothelialcellmigration,whetherE2andP4willinteracteachothertoinfluencetheendothelialcellmigration,andthemolecularmechanismsunderlyingoftheinteraction.UsingthewoundhealingassayandTranswellsassay,ourresultsshowedthatE2ataconcentrationof1nMdidnotsignificantlyaffectthemigrationofHUVEC.Incontrast,treatmentwithP4(50nM)aloneoracombinationofE2(1nM)andP4(50nM)togethersignificantlyreducedthemigrationabilityofHUVEC.Thecellsurvival,celladhesiontotheECM,andtheMMPsactivitywerenotsignificantlyaffectedbythesametreatmentconditions.UsingWesternblotanalysis,wefoundthattreatmentwithP4(50nM)aloneoracombinationofE2(1nM)andP4(50nM)increasedthelevelsofphosphorylatedcSrcanddecreasethelevelsofRhoAprotein.However,pretreatmentwithacSrcinhibitor,PP2(400nM),whichblockedcSrc,abolishedtheP4-orE2+P4-inducedmigrationinhibitionofHUVEC,suggestingthattheseinhibitionsweremediatedthroughactivatingthecSrcmolecule.Tomimictheenvironmentofuterusendometriuminvivo,VEGFataconcentrationof5ng/mLwasaddedtotheculturemedium.InthepresenceofVEGF(5ng/mL),theHUVECmigrationabilitywassignificantlyincreased.CombinedtreatmentwithVEGF(5ng/mL)andP4(50nM)abolishedthestimulatoryeffectofVEGFonendothelialcellmigration.Surprisingly,wefoundthatcombinedtreatmentwithVEGF,E2andP4togetherdidnotsignificantlychangethemigrationactivityascomparedwithtreatmentwithVEGFalone,suggestingthattheremightbeaninteractionamongE2，P4andVEGFinregulatingangiogenesisprocesses. 論文目次 目錄 中文摘要(ChineseAbstract)----------------------------------------I 英文摘要(EnglishAbstract)-----------------------------------------II 一、 緒論(Introduction)----------------------------------------1 1. 血管增生的概念（Conceptofangiogenesis） 2. 女性月經週期(Femalemenstrualcycle) 3. 性荷爾蒙的作用機制 4. RhoA參與migration的作用 5. 細胞的移動 二、 研究動機(Rationale)--------------------------------------6 三、 實驗方法與材料(MaterialsandMethods)-----------7 壹、 藥品試劑(Chemicalandreagents) 貳、 西方墨點法相關溶液(SolutionsforWesternblotting) 參、 細胞培養相關溶液(Solutionsforcellculture) 肆、 染色質免疫沉澱溶液(SolutionforchromatinIP) 伍、 質膜分離溶液(Homogenizationbuffer) 陸、 GelatinZymography I. 細胞培養 II. 化學藥品 III. 蛋白萃取 IV. 西方點墨法 V. Adhesionassay VI. Transwellsmigrationassay VII. Woundhealingassay VIII. MTTassay IX. Subcellularfractionation X. Immunoprecipitation XI. MMPactivityassay 四、 實驗結果(Results)--------------------------------------26 E2及P4對臍靜脈內皮細胞遷移能力的影響 E2及P4對於臍靜脈內皮細胞存活率的影響 E2及P4對於臍靜脈內皮細胞對細胞外基質的貼付與入侵能力的影響P4及E2對臍靜脈內皮細胞cSrc活化的影響 E2及P4抑制HUVEC遷移能力的可能分子機轉 VEGF對於E2及P4所造成內皮細胞遷移的影響 五、 討論(Discussion)----------------------------------------29 六、 結論(Conclusion)---------------------------------------33 七、 參考文獻(References)----------------------------------34 八、 圖表附錄(FigureandAppendix)---------------------36 圖目錄 圖一、女性荷爾蒙對臍靜脈內皮細胞的入侵(invasion)能力的影響------------------------------------------------------------------36 圖二、女性荷爾蒙對臍靜脈內皮細胞的移動(migration)能力的影響--------------------------------------------------------------37 圖三、高濃度的E2及P4對HUVEC移動能力的影響--38 圖四、女性荷爾蒙對於HUVEC存活率的影響------------39 圖五、女性荷爾蒙對於HUVEC對1%gelatin貼附的影響--------------------------------------------------------------------------40 圖六、女性荷爾蒙對於HUVEC所產生MMPs活性的影響--------------------------------------------------------------------------41 圖七、PR/ER/cSrc三者之間的物理關係--------------------42 圖八、女性荷爾蒙對cSrc活性的影響-----------------------43 圖九、cSrc分子參與女性荷爾蒙抑制HUVEC入侵(invasion)的情形--------------------------------------------------------------44 圖十、cSrc分子參與女性荷爾蒙抑制HUVEC遷移(migration)的情形--------------------------------------------------------------45 圖十一、女性荷爾蒙對於HUVEC表現Rhofamily蛋白質的影響-----------------------------------------------------------------46 圖十二、女性荷爾蒙對於Rhofamily由細胞質轉移到細胞膜的能力之影響-----------------------------------------------------47 圖十三、女性荷爾蒙對於VEGF所引起的HUVEC遷移能力增加的影響---------------------------------------------------------48 圖十四、女性荷爾蒙對於VEGF所引起的HUVEC侵略能力增加的影響------------------------------------------------------------49 附錄一、性荷爾蒙透過genomic和non-genomicpathway來執行生理功能--------------------------------------------------50 附錄二、細胞重組其體內的纖維結構來幫助遷移----------51 附錄三、ER-PR-cSrccomplex磷酸化cSrc進而降低HUVEC的遷移能力--------------------------------------------------------52 參考文獻 1. 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