新型冠狀病毒偵測與實驗室常用的PCR聚合酶連鎖反應技術

我們利用反轉錄酶的特性在試管中將採樣的RNA病毒的RNA進行反轉錄成互補DNA ,又稱cDNA (complementary DNA, 指由RNA當模板因互補性透過反轉錄酵素作用 ... 首頁最新消息 最新消息系所公告專題報導專題演講課務公告 新型冠狀病毒偵測與實驗室常用的PCR聚合酶連鎖反應技術2020-02-12劉少倫分子生物相關的實驗室通常都會有一台PCR機器，對生科的同學應該不陌生，平常拿來放大DNA目標片段，即使還沒實際操作的同學，課本也都教過了 (高中選修生物也有講到喔)。

這次新型冠狀肺炎病毒的威脅大家都盯著確診數字在心情起伏，然而病毒的偵測，其原理跟PCR這個課本裡的技術可是有很大的關係。

  新型冠狀病毒(2019-n-CoV, 後來WHO正式定名為COVID-19) 對全球造成很大的恐慌和傷害，世界各國都在把關努力確認疑似病例，那麼如何在短時間內確認是不是新型冠狀病毒感染呢？相信大家在一開始都有看到新聞說哪一個國家成功分離病毒株(台灣也是名列前茅的喔)，這很重要，因為一定要先看到敵人在哪裡，長怎麼樣，其中很重要的資訊就是病毒裡面的核酸序列，病毒是由蛋白質外鞘和核酸所組成，核酸有DNA和RNA核酸，他們提供了病毒所有的組成資訊。

核酸怎麼快速偵測呢？以DNA來說，由於DNA核酸序列本身具備鹼基 (A,T,C,G) 配對和互補的特性，因此1983年KaryMullis(1993年拿到諾貝爾獎)想出了一個方法可以把非常少量的核酸DNA放大，這個方法叫做聚合酶連鎖反應，就是大家耳熟能詳的PCR(polymeraseChainReaction)。

而PCR則是在病毒檢測中一個非常關鍵的生物技術。

  PCR如何運作呢?DNA的核酸鹼基有4種，A、T、C、G。

其中A和T可以互補結合，C和G可以互補結合，因此生物體內的雙股螺旋DNA有一股是另外一股互補結合繞成螺旋的。

而PCR則是利用加熱將DNA互補的雙股分開，並且設計正反向一組引子(primer)針對兩股的DNA相距一段距離的部分核酸序列互補結合作為導引，並且在試管中加入DNA聚合酶和新的核甘酸根據原本DNA序列作為模板透過引子引導延伸複製出新的一段DNA。

經過反覆循環複製，一段非常微量的DNA片段就可以被複製放大。

(同學們可以再回去翻一下課本會更詳盡，或是google一下PCR有很多製作很好的動畫可以學習喔)   冠狀病毒是RNA病毒，PCR是針對DNA進行放大，那如何應用呢? 我們利用反轉錄酶的特性在試管中將採樣的RNA病毒的RNA進行反轉錄成互補DNA,又稱cDNA(complementaryDNA, 指由RNA當模板因互補性透過反轉錄酵素作用產生的DNA)，這個步驟又稱為ReverseTranscription(RT)。

有了互補DNA之後，就可以利用上述的PCR步驟將核酸序列進行放大了，整個過程又稱為RT-PCR。

那結果如何判定呢?PCR的產物就是複製後大量的DNA, 可以經由核酸電泳分析。

然而面對需要搶時間的檢測，就發展了利用螢光標定的方式讓DNA在複製放大的過程透過機器可以及時被偵測讀取轉換成數據，也具備定量效果，這也就是及時定量PCR(RealtimePCR)，但無論那種分析方式，RT-PCR的基本原理架構需要專一性的引子才能準確反映出偵測結果。

  左圖為實驗室常用的PCR儀器，右圖為能及時定量的RealtimePCR儀器。

  但面對沒看過的新型病毒，完全不知道其核酸序列，我們怎麼設計有專一性的引子來進行RT-PCR呢? 沒有引子就無法進行核酸放大作用了。

新型冠狀病毒與同屬冠狀病毒的SARS病毒有高度的相似性，症狀也類似，而SARS病毒序列已完整解開，因此在剛爆發，病毒資訊不明的時刻可以利用SARS序列做為參考來偵測新型冠狀病毒。

以下是默克大藥廠生技部門所釋出的新型冠狀病毒RT-PCR引子組合來參考說明一下*:   下面1,2組引子序列可偵測新型冠狀病毒的準確度高，但有可能非專一性偵測到SARS病毒序列，因此會有偽陽性反應。

2019-nCoVAssay1 正向序列 CCGCAAGGTTCTTCTTCGTAAG 2019-nCoVAssay1 反向序列 TGCTATGTTTAGTGTTCCAGTTTTC   2019-nCoVAssay2正向序列 GGCTTACCGCAAGGTTCTTC 2019-nCoVAssay2反向序列 TGCTATGTTTAGTGTTCCAGTTTTC   下面3,4組引子序列不會抓到SARS病毒和其他冠狀病毒，主要針對新型冠狀病毒，但是差異度很大，不見得會偵測到所有陽性樣本。

2019-nCoVAssay3正向序列 CAGGTATATGCGCTAGTTATCAGAC 2019-nCoVAssay3反向序列 CCAAGTGACATAGTGTAGGCAATG   2019-nCoVAssay4正向序列 GCAGGTATATGCGCTAGTTATCAG 2019-nCoVAssay4反向序列 ACACTGGTAGAATTTCTGTGGTAAC   因此必須同時用不同引子組合做同一樣本偵測，1,2組是負責偵測陽性反應，3,4組是負責移除偽陽性反應。

  同時最好也還要有一組SARS病毒的陽性控制組，其引子序列為: SARSControl正向序列 GCTGTGTGTTTGCCTATGTTGG SARSControl反向序列 ACGTTCACGACTCAGTATCTCAAG   整個RT-PCR從採樣到實驗操作到realtime資料讀取分析過程的操作需要高度熟練實驗室操作的專業人員進行，試驗本身需要一定的時間，加上非常時期待檢樣本非常多，在搶時間的壓力下，在實驗室工作的同仁也是飽受壓力，非常辛苦，我們也要給這些幕後的英雄一些掌聲。

隨著病毒定序樣本不斷的完成，引子序列的的設計將會更直接準確，接著研究單位會開始著手針對病毒的序列及蛋白質外鞘結構進行分析，製造疫苗以及快篩試劑。

在此之前，當然防疫最重要，也必須靠政策、醫療、實驗室的努力和你我的密切配合才能降低傷害。

  *本篇所列舉的引子設計為默克藥廠現階段所釋出，引子序列設計隨著研究者的設計會有所不同，並非唯一。

官方檢驗用的引子組合以世界衛生組織公布為主。

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