改造RCAS反轉錄病毒載體以提升基因體DNA重組效率之研究

Cre-loxP 系統目前普遍應用於控制基因體上基因的表現，包括單或多基因功能研究條件式基因剔除、基因治療等。

本研究主要為利用Cre-loxP 系統於反轉錄病毒質體來對宿主 ... 資料載入處理中... 跳到主要內容 臺灣博碩士論文加值系統 ::: 網站導覽| 首頁| 關於本站| 聯絡我們| 國圖首頁| 常見問題| 操作說明 English |FB專頁 |Mobile 免費會員 登入| 註冊 功能切換導覽列 (188.166.176.73)您好！臺灣時間：2022/07/0321:12 字體大小：       ::: 詳目顯示 recordfocus 第1筆/ 共1筆  /1頁 論文基本資料 摘要 外文摘要 目次 參考文獻 紙本論文 QRCode 本論文永久網址: 複製永久網址Twitter研究生:羅以軒研究生(外文):Yi-HsuanLo論文名稱:改造RCAS反轉錄病毒載體以提升基因體DNA重組效率之研究論文名稱(外文):AstudytoimprovegenomicDNArecombinationefficiencybyanengineeredRCASretroviralvector指導教授:鄭旭辰指導教授(外文):Hsu-ChenCheng學位類別:碩士校院名稱:國立中興大學系所名稱:生命科學系所學門:生命科學學門學類:生物學類論文種類:學術論文畢業學年度:97語文別:中文論文頁數:103中文關鍵詞:反轉錄病毒、基因體重組外文關鍵詞:retrovirus、Cre-loxP、genomicrecombination、RCAS相關次數: 被引用:0點閱:338評分:下載:0書目收藏:0 Cre-loxP系統目前普遍應用於控制基因體上基因的表現，包括單或多基因功能研究條件式基因剔除、基因治療等。

本研究主要為利用Cre-loxP系統於反轉錄病毒質體來對宿主細胞基因體上的基因進行操作。

因為反轉錄病毒能攜帶外來基因共同嵌入宿主細胞基因體中，是一個常用於基因運送的工具，在這裡我們使用的反轉錄病毒為RCAS(ReplicationCompetentAvianSplice)質體，是從鳥類白血病毒(ALV)衍生的，RCAS能快速感染鳥類細胞且效率佳，能夠在短時間內表達特定基因於鳥類細胞中，但一顆細胞只能被感染一次，這對於多基因或基因抑制方面的研究就有些許限制。

因此我們利用RCAS質體攜帶兩個不同的lox序列於RCAS構造蛋白基因兩端，再感染鳥類細胞，就可以Cre-loxP系統中切除(excision)的原理將RCAS構造蛋白基因切除，使得細胞能夠再被第二種RCAS病毒感染。

我們建立的這套RCAS-lox系統也能同樣應用於哺乳類細胞，RCAS在感染細胞的第一步是跟鳥類細胞膜上的TVA受器結合，然而哺乳類細胞表面沒有TVA受器的存在，所以必須要先送入tv-a基因於哺乳類細胞中，RCAS才能進一步感染哺乳類細胞，再結合RCAS病毒嵌入宿主染色體的特性及Cre-loxP系統中置換的原理換入或換出我們有興趣的基因以進行研究，對於基因轉殖或基因治療等領域皆能應用。

Tocontroltheexpressionofthegeneofthegenome,Cre-loxPsystemisacommon-usedonethatincludessingleormultigeneticfunctionresearch,conditionalknockout,genetherapyetc.ThefocusofmystudyingistoexplorethepossibilityofcombiningtheCre-loxPsystemandtheretroviralvectorforgenetic-recombinationonthehostgenome.Sincetheretroviralvectorwillintegrateintothehostgenome,itisacommontoolforgenedelivery.Weusetheretroviralvector,RCAS(replicationcompetentaviansplice)thatisderivedfromtheALV(AvianLeucosisVirus).ThecharacteristicoftheRCASisfast-infection.Itcanexpressthededicatedgeneintheaviancellrapidlybuteachcellonlycanbeinfectedonce.So,inthiscondition,therewillbesomeconstraintswhilestudyingofthemulti-geneorthegene-suppression.ThusweusetheRCASplasmidtocarrytwodifferentloxsequencesonthebothsideoftheRCASstructuralgene.ThenforcingtheRCASplasmidtoinfecttheaviancell.Finally,thepresentofCreproteinwillcuttheRCASstructuralgenethenletthecellcanbeinfectedbythesecondRCASvirusbyusingtheprincipleoftheexcisionintheCre-loxPsystem.Thetheoremwecreatecanbeappliedonthemammaliancell.WhenRCASinfectedacell,itshouldrecognizetoTVAreceptoronthecellmembrane.ButthereisnoTVAreceptoronthemammaliancellsurface.WeneedtoexpresstheTVAgeneintothemammaliancell,thustheRCAScaninfectthemammaliancell.ThemethodcouldcombinetheRCASretrovirusandCre-loxPsystemtocontrolgeneexpression,itcanbeappliedonthetransgeneorgenetherapy. 口試通過書………………………………………………………………………i摘要……………………………………………………………………………iiAbstract……………………………………………………………………iii致謝……………………………………………………………………………iv目錄……………………………………………………………………………1圖表次…………………………………………………………………………4第一章、緒論…………………………………………………………………………7一、基因體基因重組之應用……………………………………………………7二、Cre/loxP重組系統…………………………………………………………9三、RCAS反轉錄病毒質體…………………………………………………10四、RCAS反轉錄病毒質體應用在哺乳類細胞……………………………11第二章、實驗原理與架構……………………………………………………………12一、結合RCAS載體與Cre/loxP系統對細胞基因體進行重組之理由……12(一)使用RCAS反轉錄病毒當做運送基因的工具之好處(二)將Cre/loxP系統運用於反轉錄病毒之應用第三章、實驗材料與方法……………………………………………………………14一、質體的構築…………………………………………………………………14(一)載體(二)基因取得(三)應用的分生實驗1.聚合酶連鎖反應2.PCRbasedQuickchangeDNA突變3.聚合酶連鎖反應產物之純化4.酵素水解反應5.純化瓊酯膠內DNA6.接合反應7.轉形反應8.DNA質體的抽取(四)將loxFAS接入RCAS(A)……………………………………………21(五)將lox511接入RCAS(A)……………………………………………23(六)將loxFAS、lox511接入RCAS(A)…………………………………24(七)將TVA接入pEGFP-C1………………………………………………24(八)將loxFAS、lox511自pF5利用BglII、KpnI限制酵素切位接入pEGFP-C1………………………………………………………………25二、細胞培養………………………………………………………………………25(一)細胞株(二)培養液配製(三)培養環境(四)凍細胞(五)持續培養(六)繼代培養(七)細胞解凍三、細胞轉染……………………………………………………………………27四、病毒的收集與濃縮…………………………………………………………27五、病毒感染……………………………………………………………………27六、反轉錄酶活性測定…………………………………………………………28七、反轉錄病毒Gag蛋白質免疫染色法…………………………………………29八、AZT抑制反轉錄病毒活性……………………………………………………30九、細胞抗生素篩選………………………………………………………………31十、細胞基因體的純化與分析……………………………………………………31第四章、實驗結果與討論……………………………………………………………32一、接入lox序列於RCAS載體中………………………………………………32(一)將loxFAS接入RCAS………………………………………………………321.DNA質體的設計與構築2.在RCAS中加入loxFAS序列後的病毒活性測試(二)將lox511接入RCAS………………………………………………………341.DNA質體的設計與構築2.在RCAS中加入lox511序列後的病毒活性測試(三)將lox511、loxFAS接入RCAS………………………………………………351.DNA質體的設計與構築2.在RCAS中加入loxFAS、lox511序列後的病毒活性測試二、在RCAS反轉錄病毒中Cre/lox系統的應用…………………………………36(一)相關的DNA質體設計與構築………………………………………………361.將TVA基因接入EGFP-C1載體中2.將loxFAS、lox511序列接入EGFP-C1載體中(二)在DF-1細胞株中，RCAS-F5在Cre重組酶作用後的變化……………36(三)在COS-1細胞株中，RCAS-F5在Cre重組酶作用後的變化…………371.RCAS-TVA系統的測試2.置換作用3.細胞基因型體分析第五章、結論…………………………………………………………………………40第六章、參考文獻……………………………………………………………………41圖表次文獻圖表次圖壹.使用條件式基因剔除的Cre/loxP重組系統與傳統基因剔除鼠之比較………47圖貳.Cre重組酶與loxP序列之結合位置……………………………………………48圖叁.Cre/loxP重組系統中的切除及反轉作用時，Cre重組酶的作用方式………49圖肆.loxP序列及突變後的loxP序列之差異………………………………………50圖伍.不同的lox序列互相辨認的可能性……………………………………………50圖陸.RecombinaseMediatedCassetteExchange(RMCE)。

在基因體中含有兩個不同的lox序列，能夠藉由Cre重組酶作用下將感興趣基因與之置換………………51圖柒.鳥類白血病病毒的構造及基因體結構………………………………………52圖捌.RCAS質體結構圖………………………………………………………………53圖玖.RCAS的生活週期………………………………………………………………54圖拾.RCAS的反轉錄作用之基因體改變及過程圖…………………………………55圖拾壹.RCAS的受器:TVA在細胞膜上的型態……………………………………55圖拾貳.RCAS-TVA系統的原理……………………………………………………56圖拾叁.RCAS-TVA系統在哺乳類細胞中的特性與應用…………………………57實驗圖表次表1.primer總表………………………………………………………………………58表2.質體的構築流程一覽表…………………………………………………………59圖1.將loxFAS序列接入RCAS載體的5''LTR之圖示……………………………60圖1A.從RCAS載體上以PCR夾出5''LTR瓊酯膠圖圖1B.從RCAS載體中夾出5''LTR接入pBluescriptIISK(+)載體之示意圖及瓊酯膠圖圖1C.利用PCR在夾出之5''LTR兩端加入單一限制酵素切位之定序圖圖1D.用modifiedQuickChange將loxFAS序列接入5''LTR後之確認圖1E.加入loxFAS序列至5''LTR之定序圖圖1F.將5''FAS從原pBluescriptIISK(+)載體換入Litmus29載體中之示意圖及瓊酯膠圖圖1G.將含有loxFAS的5''LTR從Litmus29載體換入pCR2.1TOPO載體中之示意圖及瓊酯膠圖圖1H.將加入loxFAS的5''LTR(5''FAS)接入RCAS載體的SacI限制酵素切位之示意圖及瓊酯膠圖圖1I.將含有loxFAS序列的5''LTR接入RCAS載體的molecularcloningsite之設計圖圖2.將lox511序列接入RCAS載體的3''LTR之圖示………………………………69圖2A.從RCAS載體上以PCR夾出3''LTR瓊酯膠圖圖2B.從RCAS中夾出3''LTR接入pCR2.1TOPO載體之示意圖及瓊酯膠圖圖2C.利用PCR在夾出之3''LTR兩端加入單一限制酵素切位之定序圖圖2D.將3''LTR從pCR2.1TOPO載體換成pBluescriptIISK(+)載體之示意圖及瓊酯膠圖圖2E.用modifiedQuickChange將lox511序列接入3''LTR後之確認圖2F.加入lox511至3''LTR之定序圖圖2G.將含有lox511的3’LTR(3''511)從原pBluescriptIISK(+)載體換入pBC/ClaI2載體中之示意圖及瓊酯膠圖圖2H.將加入lox511的3''LTR(3''511)利用ClaI限制酵素切位接入RCAS載體之示意圖及瓊酯膠圖圖2I.將含有lox511序列的3''LTR接入RCAS載體的molecularcloningsite之設計圖圖3.以反轉錄酶試驗分別測試在RCAS的5’LTR中加入loxFAS及在RCAS的3’LTR中加入lox511的反轉錄病毒活性之結果與分析……………………………79圖4.將加入lox511的3''LTR(3''511)從ClaI限制酵素切位接入已含有5''FAS之RCAS載體之示意圖及瓊酯膠圖…………………………………………………80圖5.含有loxFAS、lox511的RCAS(RCAS-F5)的病毒活性測試………………81圖6.在DF-1細胞株中，RCAS-F5在Cre作用後的變化…………………………82(A)感染RCAS-GFP後一天(B)感染RCAS-GFP後三天及passage後的結果圖7.將TVA接入pEGFP-C1流程圖……………………………………………86圖7A.將TVA序列以EcoRI、XmaI限制酵素切位接入pBluescriptIISK(+)載體之示意圖及瓊酯膠圖圖7B.以T7和T3引子夾出位於pBluescriptIISK(+)載體上之TVA序列之示意圖及瓊酯膠圖圖7C.將TVA序列以PCR夾出後之定序結果。

上排為鵪鶉之TVA序列，下排為送定序的sample圖7D.將TVA序列以KpnI限制酵素切位接入pEGFP-C1載體之示意圖及瓊酯膠圖圖8.RCAS-TVA系統表現於COS-1細胞株…………………………………………91(A).感染後24小時之結果(B).感染後48小時之結果(C).感染後第四天、第八天之結果(D).感染後以胰蛋白酶(trypsin)處理過之情形(E).感染後以共軛焦顯微鏡拍照之結果。

圖9.利用BglII和KpnI限制酵素切位將loxFAS、lox511序列從pF5載體上接入EGFP-C1載體之示意圖及瓊酯膠圖………………………………………………96圖10.將Cre/lox系統的重組功能應用於RCAS載體之實驗流程圖………………97圖11.將Cre/lox系統的置換作用應用於RCAS載體之基因體分析圖……………98圖12.用G418篩選置換成功的穩定細胞株…………………………………………99圖13.用BamHI、NdeI分別digestion純化好的基因體DNA……………………100圖14.將接合反應後的產物送入勝任細胞中進行轉形作用後其菌株生長情形…101圖15.抽取一穩定細胞株的質體DNA後送定序之結果…………………………102圖16.從10cmdish分離綠色螢光細胞株至24welldish後不健康的細胞型態…103 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