單細胞組學

前言

細胞作為生命最為基本的一個單元概念，是生命活動的基石。

儘管生物學家在顯微鏡下工作了將近 180 年，但我們對細胞仍然不甚了解。

本文著重探討了研究人員如何通過觀察單獨的細胞來了解細胞的性質——存在多少種不同的細胞、它們做了什麼以及它們如何發生改變。

我們期望有有效的技術手段，可以完整地檢查單個細胞的成分，包括在細胞，甚至分子水平上鑑定和治療疾病。

對病理學理解的推進將使我們能夠預測基因是如何使個體易患疾病，並幫助預防和治療疾病的。

這對於諸如癌症等疾病尤其重要，其通常具有極其多變的遺傳組合物，從而在單一腫瘤內導致不同的基因表達譜。

儘管縮小自身的技術仍然是虛構的，但我們在單細胞水平上想像基因如何行動的能力卻不是，我們期待著擴大對人體的認識。

本文詳細描述了譜系追蹤的成果，揭示了複雜的生物體是如何由一個細胞，然後是兩個，然後是四個，看起來相同的胚胎細胞構建而成的。

單細胞組學研究比常規的細胞群體研究可以揭示更多細胞類型和亞群的多樣性。

這就是為什麼麻薩諸塞州 Broad Institute 的 Aviv Regev 等科學家建立人類細胞圖譜計劃，並積極參與對人體內各種細胞的分類的原因。

這樣的工作有著重要的治療意義，因為跟蹤不同腫瘤細胞之間的差異可以指導治療。

此外，最近的技術進步使我們能夠在單細胞水平上鑑定和可視化 RNA 轉錄物、蛋白質和其它細胞成分。

這揭示了免疫系統、大腦和胚胎髮育過程，並且將徹底改變我們對整個人體的認知。

近年來，已有越來越多的科學家進入單細胞分析領域，其中包括經典的細胞生物學、發育生物學、基因組學和計算生物學領域。

而隨著研究單細胞的技術的不斷增加，人們將需要複雜的分析工具來分析和理解結果。

正如細胞理論為生物學上的非凡進展提供了支持依據，單細胞分析顯然將為科學家開拓新的前景。

個體細胞有遺傳「指紋」的能力，使我們能夠發現它們的微妙差異。

人類細胞圖譜計劃

細胞是生命的基本單位，Aviv Regev 教授長期以來一直在尋找探索複雜的基因網絡在單個細胞中的運作機制的方法，並想了解各個細胞中這些網絡有何差異，以及最終各種細胞群體如何協同工作。

這些問題的答案將從本質上揭示細胞如何構建複雜的生物體，如人類。

在麻省理工學院和哈佛大學麻省理工學院工作的 Regev 和 Levin 對來自小鼠骨髓的 18 個看起來相同的免疫細胞的 RNA 進行了測序，結果發現其中一些細胞與其餘細胞的基因表達模式截然不同。

這些細胞感覺就像兩個不同的細胞亞型。

這使 Regev 想要進一步開展深入的研究，即使用單細胞測序來了解人體內存在多少種不同的細胞類型、它們在哪個部位，以及它們如何發揮作用。

Regev 的實驗室同時對 18 個細胞進行檢測，一共測定了數十萬個 RNA 的序列，並將單細胞分析與基因組編輯技術結合起來，以了解關鍵調控基因被抑制時會發生什麼情況。

2016 年末，Regev 幫助推出了「國際人體細胞圖譜計劃（Human Cell Atlas）」，該計劃雄心勃勃，準備對人體中所有（估計 37 萬億個）細胞進行分類和測序（圖「建立人類細胞圖譜」）。

建立細胞圖譜的方法。

組織分離成細胞，進行測序和數據分析，最後完成投射。

人體細胞圖譜項目計劃對人體各種細胞的 RNA 進行測序，然後使用這些基因表達譜將細胞分類，定義新的細胞，並繪製所有細胞及其分子在空間上的組織方式。

該項目還旨在發現和表徵人體內所有可能的細胞狀態——成熟和不成熟、滿負荷和充分工作狀態——這需要更多的測序。

科學家認為，人體內大約有 300 種主要的細胞類型，但是 Regev 懷疑有更多的狀態和亞型需要探索。

她還認為，單獨的視網膜似乎就含有 100 多種亞型的神經元。

在共同部署人體細胞圖譜項目時，Regev 已經召集了來自五大洲的 28 人的委員會，並協助組織了有 500 多名科學家參加的會議。

在最基本的層面上，人類細胞圖譜必須包含一個全面的人類細胞參考目錄，因為它們包含細胞穩定性和瞬時特徵，以及它們的位置和豐度。

此外，圖譜必須提供一個坐標系統，從而在多個層面表達和協調概念，並且我們可以在這個圖譜可的任何級別的放大視圖中查看特徵，並將高維信息摺疊成更簡單的視圖。

由於一個細胞可能包含 2 萬個基因表達情況，所以我們需要能夠降低維度的分析工具。

此外，圖譜應具有附加的坐標或注釋，以表示組織學和解剖學信息（例如，細胞的位置、形態或組織），時間信息（例如，自暴露後個體的年齡或時間）和疾病狀態。

這些信息對於根據分子譜和關於細胞生物學、組織學和功能的背景來協調結果至關重要。

人類基因組計劃對生物醫學產生了重大影響，提供了一個全面的參考資料。

我們可以很輕易地通過一個 DNA 序列查找答案，並從中挖掘獨特的「特徵」。

人類細胞圖譜可以為基礎研究提供類似的臨床相關應用的好處。

這種細胞特性的概括將被廣泛用於臨床檢測。

例如，今天的全血細胞計數（CBC），一個有限數量的血液成分的普查，可以補充一個「CBC 2.0」，以提供有核細胞的高解析度圖片，包括每個的數量和活動狀態與健康參考樣本進行比較。

類似的措施也應該可以用於其它組織。

例如，可以分析來自潰瘍性結腸炎或結腸癌患者的腸道活檢組織，了解其包含的各種上皮細胞、免疫細胞、基質細胞和神經細胞的類型、反應、狀態和位置。

單細胞組學技術

目前，單細胞生物學是一個熱門話題。

該領域的最前沿研究是單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）。

RNA 測序的常規「批量」方法（RNA-seq）可一次處理數十萬個細胞，並平均差異。

事實上，沒有兩個細胞是完全相同的，scRNA-seq 則可以揭示使每個細胞獨特的微妙變化。

它甚至可以揭示全新的細胞類型。

Regev 等人利用 scRNA-seq 探測 2400 多種免疫系統細胞後，發現了一些具有強烈 T 細胞刺激活性的樹突狀細胞。

一種刺激這些細胞的疫苗可能有助於激活免疫系統，預防癌症的發生。

但是，操縱個體細胞要比大群體難得多，因為每個細胞只產生少量的 RNA，所以沒有出錯的餘地。

不僅僅是因為使用的工具，另一個問題是分析方法可能會導致大量數據的展示不夠直觀。

由於數據文件從一個軟體包傳遞到下一個軟體包，每個工具都在處理一個步驟：基因組比對、質量控制和變異調用等，所以這個過程很複雜。

但是對於批量 RNA-seq 來說，至少已經達成共識，哪些算法對每一步是最好的，以及它們應該如何運行。

因此，現在存在的「流水線」即使不是完全即插即用，至少對於非專家來說也是非常容易處理的。

但對於 scRNA-seq 而言，研究人員仍在研究他們可以對數據集做些什麼，哪些算法是最有用的。

但一系列在線資源和工具正在減輕 scRNA-seq 數據分析的工作量。

GitHub 上一個名為「Awesome Single Cell」（go.nature.com/2rmb1hp）的頁面包含了 70 多個工具和資源，涵蓋了分析過程的每一步。

單細胞 RNA-Seq（scRNA-seq）是指一類分析單個細胞轉錄組的方法。

其中一些可能通過聚焦於 3'或 5' 末端進行 mRNA 種類的篩選，而另一些則通過收集近全長序列來評估 mRNA 結構和剪接。

單細胞分離策略涵蓋人工細胞分選（起初用於微陣列研究）、基於流式細胞儀的分選、微流體裝置，以及最近的基於微滴的和基於微孔的方法。

當前連接到 3' 端計數的液滴和微孔進樣具有最大的通量，允許在單個樣品中同時快速處理數萬個細胞。

人們通常將 scRNA-seq 應用於新鮮解離的組織，但新興的方案使用固定的細胞或從冷凍或輕微固定的組織分離的細胞核。

固定或冷凍樣品的應用將簡化 scRNA-seq 的工藝流程，並為全面了解表達譜提供了可能。

功效分析為比較這些方法的靈敏度和準確性提供了一個適用框架。

質量流式細胞術（CyTOF）和相關的方法允許基於用重金屬條形碼化的抗體進行蛋白質的多重測量。

這些方法提供了預設的標籤，並且需要針對每個目標的合適抗體，但是它們可以處理數百萬個細胞，而且每個細胞所需的成本非常低。

這些方法被應用於固定的細胞。

最近，該方法已經擴展到通過用重金屬標記的核酸探針的多重雜交來測量 RNA 特徵了。

單細胞基因組和表觀基因組測序可鑑定細胞基因組。

基因組方法的目的是鑑定整個基因組或捕獲特定的預定義區域。

表觀遺傳學方法可以基於獨特的組蛋白修飾（單細胞 ChIP-Seq）、開放性（單細胞 ATAC-Seq）、或同樣鑑定 DNA 甲基化模式（單細胞 DNAme-Seq）或 3D 組織（單細胞 Hi -C）來捕獲特定的預定義序列。

目前人們已經使用組合條形碼策略來捕獲數萬個單細胞。

單細胞表觀基因組學方法通常只研究細胞核，因此可以使用冷凍或某些固定的樣品。

由於基因組的大小和測序深度的限制，目前一些方法（如單細胞 DNA 測序）只能應用於相對較少的細胞。

其它方法，如染色質組織的單細胞分析（通過單細胞 ATAC-Seq）或單細胞 ChIP-Seq 產生的數據相對稀少，這說明對大量異形單元的分析既有挑戰又有益處。

計算分析已經可以通過將信號匯集到細胞之間以及跨基因組區域或基因座來解決這些問題。

單細胞組學的應用

單細胞組學可以有效判斷某類細胞的分化和譜系追蹤。

細胞通過分化異步分支途逕到達它們最終分化成的細胞類型。

這是由分子變化所驅動，並反映在分子變化中的，特別是通過基因表達模式來完成的。

因此，單細胞組學技術能將細胞演化過程發展重建為高維空間的軌跡，反映出 Waddington 的模式。

只要觀察到足夠的細胞，人們甚至可以推斷出一些突發事件。

所需的採樣密度將取決於路徑和交叉點的數量和複雜性，良好的分類策略有助於分析稀有的細胞亞群。

值得注意的是，沿發育路徑不同點觀察到的細胞的相對比例可以幫助傳達關鍵信息，包括每個階段的持續時間和祖細胞。

儘管我們仍然需要更好的算法，但是最初的計算方法已經能夠用於從大量的單細胞分布圖推斷動態軌跡。

關鍵的挑戰包括準確推斷分支結構，其中兩個或更多個路徑與單個點分離；重建「快速」轉變，只有少數細胞可以被捕獲；並且考慮到細胞可能同時遵循多個動態路徑的事實。

線性發育軌跡已經能被重建，例如，從 B 細胞分化過程中的單細胞蛋白表達和體外成肌過程中的單細胞 RNA 表達、早期造血、體內神經發生和從成纖維細胞重編程為神經元等。

分化的軌跡在胚胎幹細胞、T 輔助細胞和造血細胞的分化中也被重建，並且幫助人們解決了關於骨髓中的骨髓祖細胞是否已經傾向於不同命運這一懸而未決的問題。

人類細胞圖譜將成為研究疾病的重要參考，其涉及正常的細胞功能、相互作用、比例或生態系統的破壞。

在數十年的組織病理學研究和 FACS 分析中，疾病的單細胞表現出的分析能力是顯而易見的。

它還將支持人們對理解異常細胞與組織生態系統中促進或抑制疾病過程（例如惡性細胞和腫瘤微環境之間）的所有其它細胞之間的相互作用。

血液系統將是一個早期和富有成效的目標。

基於單細胞組學技術對造血幹細胞進行分析，我們可以更精確地分類急性髓細胞性白血病中的造血幹細胞和造血祖細胞。

此外，監測在正常情況下首次發現的罕見免疫人群也可以幫助消除疾病中的相關畸變。

短期內，受單細胞組學影響最大的可能是腫瘤。

早期的研究使用單細胞 qPCR 來研究癌症幹細胞的放射抗性的起源，並解析了結腸癌中細胞層次的異質性。

隨著高通量方法的出現，單細胞基因組分析已被用於研究乳腺癌和急性淋巴細胞白血病中腫瘤的克隆結構和進化，並推斷引起急性骨髓性白血病的最早突變的順序。

在惡性細胞中，單細胞組學技術可以鑑定出不同的細胞狀態，如癌症幹細胞、耐藥狀態、增殖和靜止細胞，並且可以在個體患者中輕易地鑑定出單獨的亞克隆。

在非惡性細胞中，T 細胞具有不同的功能狀態，並且，儘管激活和耗竭的過程是耦合的，但是耗盡狀態也由人類腫瘤中的獨立調節程序控制。

參考文獻：

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