ALK陽性NSCLC患者克唑替尼耐藥的機制和治療措施

肺癌是全球發病率和致死率最高的疾病之一。

2014年世界衛生組織發布《World Cancer Report 2014》。

該報告顯示，肺癌以每年180萬的新發病例和160萬的死亡病例，高居所有癌症發病率和死亡率之首。

報告同時指出，在我國，隨著空氣污染等問題的日趨嚴重，每年肺癌新發病例為67.6萬，死亡病例56.5萬，均居世界各國肺癌發病率和死亡率的第一位。

非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌最為常見的組織學類型，約占總體的80%-85%[1-3]。

近些年，隨著分子生物學和轉化醫學的快速發展，人們對NSCLC的認識已經從組織水平深入到分子水平，越來越多的腫瘤驅動基因被陸續鑑定出來。

而針對這些驅動基因的靶向藥物已經取代傳統的化療，成為帶有這些驅動基因的晚期NSCLC的標準治療方案。

在NSCLC中最具有代表性的靶向藥物是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）和間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase, ALK）酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors, TKIs）。

相關的III期臨床試驗也證實了這些TKIs可以使帶有EGFR突變和（或）ALK融合基因的NSCLC患者得到明顯的緩解和生存獲益[4-6]。

不幸的是，目前幾乎所有的TKIs在初始治療後的9個月-12個月都會出現耐藥問題[7,8]。

耐藥現象已經成為TKIs臨床應用最普遍也是最大的障礙，同時也是提高晚期NSCLC患者生存時間最亟待解決的問題。

有關EGFR-TKIs的耐藥機制及其應對策略已經有很多文章進行闡述[9-12]，而對於ALK TKIs治療後出現耐藥問題的機制和相應的治療策略還未曾有過詳細的綜述。

因此，本文針對一代ALK TKI（克唑替尼）治療ALK融合基因陽性的NSCLC患者（ALK+ NSCLC）後，引起耐藥問題的機制和有關後續治療策略做一綜述。

1 克唑替尼治療後的耐藥機制

克唑替尼是一種口服型小分子ATP競爭性的ALK抑制劑，它可以抑制c-Met激酶，破壞c-Met的信號轉導通路，進而抑制ALK融合基因，達到抑制腫瘤細胞生長的效果[13,14]。

ALK融合基因發生於3%-7%的NSCLC患者[15,16]，臨床上常見於不吸菸的年輕腺癌患者，通常與EGFR或KRAS突變的發生互相排斥[17]。

克唑替尼的出現顯著改善了該類亞型NSCLC患者的預後，其治療客觀緩解率（objective response rate, ORR）達60%，無進展生存期（progression free survival,PFS）達8個月-10個月，總生存期（overall survival, OS）顯著延長[18-20]。

儘管ALK+ NSCLC患者的獲益明顯，但這部分患者往往在1年-2年內出現對克唑替尼耐藥，且中樞神經系統的復發進展較為常見[21]。

已經發現的耐藥機制主要有以下幾種。

1.1 ALK繼發性耐藥突變

ALK+ NSCLC患者出現繼發性耐藥問題，約37%歸因於ALK繼發性耐藥突變。

這其中又可以分為ALK激酶區突變（28%）和ALK基因拷貝數擴增（9%）。

ALK激酶區突變是最早明確的耐藥機制[22,23]。

體外和基於患者標本的研究揭示ALK+ NSCLC繼發耐藥的患者存在數種ALK激酶區突變，包括：L1196M、L1152R、G1202R、G1269A、1151Tins、S1206Y、C1156Y、F1174C和D1203N。

數量上微占優勢的是L1196M，它是一種類似於T790M的看家基因[24,25]。

在首例公開報導的克唑替尼耐藥的病例的同一個腫瘤標本中即發現了L1196M和C1156Y的突變。

Doebele等[22]對14例經克唑替尼治療後出現繼發性耐藥的ALK+ NSCLC患者的標本進行螢光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）檢測，結果發現三分之一的患者出現了ALK激酶區的二次突變，主要為L1196M、G1269A和C1156Y。

與之相似，Katayama等[23]對18例克唑替尼獲得性耐藥的ALK+ NSCLC患者進行了FISH和免疫組織化學法（immunohistochemistry, IHC）檢測，發現約四分之一的患者出現了ALK激酶區的二次突變，並且在體外實驗中證實了這些突變導致了ALK+腫瘤細胞對克唑替尼的耐藥。

ALK融合基因拷貝數擴增首次是在ALK+細胞系出現對克唑替尼耐藥時發現的，隨後在對克唑替尼耐藥的ALK+ NSCLC患者標本中也發現了拷貝數增加。

在Katayama等[23]的試驗中，FISH檢測18例繼發性耐藥的患者的標本也發現了1例患者ALK融合基因拷貝數擴增。

同樣，相應的體外實驗也證實了ALK融合基因拷貝數擴增可以導致ALK+腫瘤細胞對克唑替尼的耐藥。

值得一提的是，當ALK融合基因激酶區突變或拷貝數擴增時，ALK信號通路往往會被保留，並在腫瘤的生存和耐藥過程中發揮一定的作用。

因此，更加有效的第二代ALK抑制劑也許能夠克服這些機制引起的繼發性耐藥問題。

該類型的耐藥也被稱為ALK占優勢的耐藥。

1.2 驅動基因轉換

ALK+腫瘤細胞主要通過ALK及其下游信號通路來控制腫瘤細胞的生長和遷移。

當使用克唑替尼阻斷該信號通路時，腫瘤細胞會通過另外一些機制（如轉換驅動基因）來激活其他信號通路，取代腫瘤細胞對ALK及其下游信號的依賴，導致克唑替尼不能有效地抑制腫瘤細胞的生長。

該類型的耐藥又被稱為ALK不占優勢的耐藥。

這些轉換驅動基因中最為常見的是EGFR突變或磷酸化、KRAS突變和c-KIT擴增。

Doebele等[22]和Katayama等[23]的研究均發現，在未接受和已經接受克唑替尼治療的ALK+NSCLC患者的標本中均發現激活的EGFR或KRAS的突變。

Katayama等[23]對18例克唑替尼耐藥的標本進行IHC檢測，發現有17例標本出現EGFR磷酸化，提示存在不同程度的EGFR通路激活。

在細胞系的研究中發現，抑制EGFR磷酸化可以恢復耐藥細胞株對克唑替尼的敏感性。

另外，上述研究中，18例標本經FISH檢測發現了2例高水平的c-KIT擴增，IHC檢測也證實了這一結果。

同時通過IHC檢測還發現在這些c-KIT擴增的耐藥標本的間質細胞中，c-KIT的配體幹細胞因子（stem cell factor, SCF）也存在高表達現象。

體外實驗證實了c-KIT擴增介導的克唑替尼耐藥現象需要高表達的SCF的參與，而克唑替尼聯合伊馬替尼則可以有效抑制這種機制導致的耐藥現象。

1.3 腫瘤異質性

NSCLC是基因和細胞異質性最大的腫瘤之一。

儘管最近幾十年分子生物學技術的發展，讓我們對NSCLC的認識從組織病理的水平深入到分子和遺傳甚至單細胞水平，但是，對於腫瘤異質性及其導致有關的耐藥問題，我們仍然缺乏更深入的了解[8]。

事實上，我們已經在多種耐藥腫瘤中觀察到腫瘤異質性的存在。

比如，對同一個ALK+ NSCLC患者的耐藥腫瘤標本進行檢測，分別鑑定出了兩種不同的激酶區突變，而一些被鑑定的腫瘤細胞不存在這些突變。

另一個患者的耐藥標本則同時檢測出了基因拷貝數擴增和突變[26,27]。

但是目前並不知道這些變異是否都存在於相同的細胞內。

2014年美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology, ASCO）會議上報導了一個關於多發肺結節的NSCLC患者驅動基因的分布情況。

研究納入35例雙肺多發肺結節的NSCLC患者，分別檢測其驅動基因分布情況，結果發現不同結節的突變驅動基因的不一致率達到68.6%。

這些結果都表明：對於NSCLC患者而言，在不同時間和不同空間其腫瘤細胞可能存在不同的驅動基因突變。

那麼，一塊很小的活檢組織的分子檢測結果能否代表整個腫瘤組織？有限的檢測能否顯示所有的細胞耐藥的類型？腫瘤細胞異質性的存在讓耐藥問題更加錯綜複雜，要徹底解決耐藥問題，首先需要更多地了解腫瘤異質性的起源等問題。

2 克唑替尼耐藥後的治療策略

2.1 二代ALK抑制劑

第二代ALK抑制劑的結構和克唑替尼有很大的不同，因而能夠抑制ALK繼發性耐藥突變。

臨床前研究也已經證實，第二代ALK抑制劑不僅對存在ALK融合基因陽性的腫瘤細胞具有活性，而且對已經鑑定出來的多種ALK激酶區耐藥突變均具有活性。

這些藥物包括：alectinib（CH5424802）、ceritinib（LDK-378）和AP26113。

2.1.1 Alectinib Alectinib是一種強效的選擇性ALK抑制劑，其效力比克唑替尼強10倍，能有效對抗大多數的ALK激酶區突變[28]。

在日本進行的一項多中心、單臂開放的I期/II期研究對未接受克唑替尼治療的晚期NSCLC患者進行的劑量遞增試驗，試驗中患者每日口服alectinib兩次[29,30]。

I期試驗納入的24例患者每日口服20 mg-300 mg的alectinib兩次。

在最高最大劑量耐受組未觀察到劑量限制性毒性，也未見4級不良事件的報告。

因此II期臨床研究選取了每次300 mg、每日兩次的用藥方案。

共計46例患者以推薦劑量進行了治療，其中43例患者獲得客觀緩解，客觀緩解率（objective response rate, ORR）達93.5%（95%CI: 82%-98.6%），其中2例（4.3%）為完全緩解。

12例（26%）患者出現了治療相關的3級不良反應，包括中性粒細胞減少和血液肌酸激酶含量升高。

5例患者出現了嚴重的副作用（11%）。

中位PFS尚未達到。

基於這一結果，日本衛生部、勞動和福利局批准了該藥的使用。

同樣在美國，食品與藥物管理局（Food and Drug Administration, FDA）已經批准alectinib用於克唑替尼治療後發生進展的ALK+ NSCLC患者的治療，並授予該藥突破性治療的稱號。

2.1.2 Ceritinib Ceritinib是瑞士諾華公司研發的二代ALK抑制劑。

其體外研究[31]表明：ceitinib對ALK+並表達突變C1156Y的腫瘤細胞均具有良好的活性。

Ceritinib的劑量遞增I期單臂試驗計劃入組131例ALK+的經過標準治療失敗的進展期腫瘤患者[32]。

試驗分為3個組；之前接受過克唑替尼治療的ALK+ NSCLC，之前未接受過克唑替尼治療的ALK+ NSCLC和ALK+的除肺癌之外的其他惡性腫瘤。

截止2012年11月8日，共入組130例患者，其中59例為劑量爬坡組，確認最大耐受劑量（maximum tolerated dose, MTD）為750 mg/d；後續71例患者為MTD擴展組。

在79例對克唑替尼耐藥的ALK+ NSCLC亞組中，ORR為57%。

剩餘35例未經克唑替尼治療的ALK+ NSCLC組中，ORR為60%。

在114例NSCLC患者中，中位PFS為8.6個月（95%CI: 5.7-9.9）。

最常見的不良反應為噁心（73%）、腹瀉（72%）、嘔吐（58%）和疲勞（41%）。

最常見的3級-4級不良事件為丙氨酸氨基轉移酶升高（19%），天冬氨酸氨基轉移酶升高（10%）和腹瀉（8%）。

該項研究結果表明LDK378在400 mg/d-750 mg/d劑量範圍內顯示出較強的抗腫瘤活性（無論其是否接受過克唑替尼治療）。

最常見的不良反應為噁心、腹瀉、嘔吐和乏力，且多為1級或2級，患者耐受性較好。

目前ceritinib已經被FDA批准用於進行多項其他II期和III期的臨床研究。

2.1.3 AP26113 AP26113是一種新型的ALK-/EGFR-TKI雙重抑制劑，可強效抑制ALK L1196M突變和EGFR T790M突變[33,34]。

一項開放標籤、多中心I期/II期臨床試驗共納入44例晚期實體瘤病例，37例是耐受現有治療藥物或沒有標準治療的NSCLC。

患者每日口服1次的AP26113。

與治療相關的3級-4級最常見不良事件為腹瀉（5%）。

兩種劑量限制性毒性出現在240 mg劑量組（丙氨酸轉氨酶升高3級事件）和300 mg劑量組（呼吸困難4級事件）。

II期臨床試驗以<300 mg的劑量進一步研究，設4個受試群體：ALK+ NSCLC初治組、ALK靶向治療後耐藥組、耐藥EGFR突變型組、其他ALK變異或其他以AP26113為靶點的腫瘤。

綜上所述，第二代ALK抑制劑對於仍依賴於ALK信號通路的ALK激酶區耐藥突變也許是最佳的選擇。

2.2 聯合其他治療

上文提到，不占優勢的ALK耐藥突變存在其他信號旁路激活的現象。

因此，應用ALK抑制劑和其他信號傳導通路抑制劑，有可能改善此類機制導致耐藥問題的臨床療效。

2.2.1 聯合熱休克蛋白（heat shock protein 90, HSP90）抑制劑HSP90是一類稱為「分子伴侶」的蛋白質，可幫助新合成的蛋白質形成發揮他們特定生物學功能的正確形狀[35]。

體外細胞系研究中發現HSP90的抑制劑ganetespib對ALK+的未經過克唑替尼處理或對克唑替尼耐藥的細胞系均有活性[21,36]。

一項關於ganetespib的II期臨床試驗中[37]，ganetespib單藥治療ALK基因重排的IIIb期/IV期NSCLC，患者之前未接受過直接ALK抑制劑治療。

主要終點是ORR，計劃招募受試者約100例。

目前試驗正在進行中，已經報導的結果顯示4例獲部分緩解的病例均為未經克唑替尼治療的ALK陽性型。

最常見不良反應為腹瀉、乏力、噁心和食慾減退。

另一種HSP90抑制劑是AUY922[38]，目前正在進行用於包括ALK+NSCLC在內的II期試驗。

劑量為每周70 mg/m2，121例受試者均為復治NSCLC患者。

22例ALK+病例中，客觀緩解7例（32%），其中3例是克唑替尼耐藥者；疾病控制率為59%（未經克唑替治療組為100%，克唑替尼耐藥組為36%）。

不良事件主要是1級-2級事件，包括眼睛不適（77%）、腹瀉（74%）和噁心（46%）。

其他聯合HSP90抑制劑與選擇性ALK抑制劑的臨床研究正在進行中（NCT 01712217和NCT01579994）。

2 .2 .2 聯合其它TKI 既往的研究[39, 4 0]表明，在A LK+NSCLC患者中，5%-8%的ALK+細胞並存EGFR突變。

在基於亞裔患者的研究[27]中發現，18.6% ALK+患者合併EGFR突變；3.9%的EGFR突變患者合併ALK融合。

對於這些患者，聯合使用EGFR和ALK TKI相對於單獨使用任何一種TKI可以起到更好的抑制效果。

但是目前該結論多見於病例報導研究，尚缺乏相關的大型臨床數據的支持。

2.2.3 聯合化療 EGFR突變陽性NSCLC患者對EGFR-TKI耐藥後，立即停止EGFR-TKI治療可導致腫瘤出現「閃耀」現象（即暴發性進展），可能的原因是停止EGFR-TKI治療後，對EGFR-TKI敏感的細胞再次快速增殖，導致腫瘤暴發性生長。

同理，對克唑替尼敏感的ALK+ NSCLC亦可出現相似的過程。

因此，當該類患者出現對克唑替尼獲得性耐藥時，在全身化療同時是否需要繼續克唑替尼治療，尚無確切答案，通過一些前瞻性臨床研究有助於回答這一問題。

正在設計的SWOG1300研究即是針對ALK+ NSCLC患者出現克唑替尼耐藥後隨機分配至培美曲塞單藥或培美曲塞聯合克唑替尼治療組。

值得關注的是，在這項研究中，如果單藥培美曲塞治療失敗後，將允許患者再次接受克唑替尼治療。

基於此研究，亦能回答「在具有明確腫瘤驅動基因的患者出現獲得性耐藥後，兩種不同的治療模式孰優孰劣（繼續原小分子靶向藥物聯合全身化療 vs 先全身化療，待疾病再次進展後重新使用小分子靶向藥物）」這一問題。

研究結果將對臨床實踐具有重要的指導意義。

2.3 繼續克唑替尼治療

對於靶向藥物治療出現獲得性耐藥的NSCLC患者，一個很重要的觀點是認為這種耐藥往往不完全，因此當疾病進展時，仍有部分腫瘤細胞能夠繼續被靶向藥物所抑制。

一項關於繼續使用克唑替尼抑制ALK+ NSCLC疾病進展的研究[41]發現，克唑替尼治療ALK+NSCLC患者疾病進展後，繼續使用克唑替尼對比未使用克唑替尼，6個月總生存率為76.3% vs 31.2%，1年總生存率為64.7% vs 32.9%，OS為16.4個月 vs 3.9個月。

對其總生存的Cox生存分析發現，克唑替尼持續使用可以使生存獲益（風險比：0.27，95%CI: 0.17-0.45，P<0.000,1）。

而患者的性別、吸菸史、體力狀態評分等對生存均無影響。

對於具有驅動基因突變的NSCLC患者，在更改治療方式之前，區分出僅可檢測的疾病進展與臨床進展非常重要。

這是由於某些患者雖然出現了局部的、無症狀性進展，但與接受靶向治療之前相比，腫瘤負荷仍能有較好的控制。

還有些患者發現疾病進展後停用TKI，出現了疾病暴發性進展。

這時給予患者同一種TKI或作用於同一靶點的不同種TKI，疾病可再次獲得良好控制。

該現象說明TKI仍能抑制對其敏感的腫瘤細胞亞群。

因此，區分不同的耐藥模式對後續治療至關重要。

3 結論

克唑替尼是繼EGFR-TKI類藥物用於治療EGFR突變的NSCLC靶向藥物後又一重要的小分子靶向抑制劑，其對帶有ALK融合基因陽性的NSCLC患者顯示了良好的臨床效果。

然而由於多種原因導致的耐藥問題則限制了克唑替尼的臨床應用。

對於克唑替尼耐藥機制的深入探討將有助於我們改善這類患者的臨床結局。

我們應該清楚，目前出現的二代ALK抑制劑等藥物，雖然可以克服一代ALK TKI的部分耐藥問題，但是解決耐藥問題的最佳方法還有待於我們對腫瘤異質性的深入研究。