基因晶片及其最新進展

80年代中期，俄羅斯科學院恩格爾哈得分子生物學研究所和美國阿貢國家實驗室(ANL)的科學家們最早在文獻中提出了用雜交法測定核酸序列(SBH)新技術的想法。

當時用的是多聚寡核酸探針。

幾乎與此同時英國牛津大學生化系的Sourthern等也取得了在載體固定寡核苷酸及雜交法測序的國際專利。

基因晶片利用微電子、微機械、生物化學、分子生物學、新型材料、計算機和統計學等多學科的先進技術，實現了在生命科學研究中樣品處理、檢測和分析過程的連續化、集成化和微型化。

1997年世界上第一張全基因組晶片——含有6166個基因的酵母全基因組晶片在史丹福大學Brown實驗室完成，從而使基因晶片技術在世界上迅速得到應用。

基因晶片技術主要包括四個基本要點：晶片方陣的構建、樣品的製備、核酸分子反應和信號的檢測。

1、晶片製備，先將玻璃片或矽片進行表面處理，然後使核酸片段按順序排列在晶片上。

2、樣品製備，可將樣品進行生物處理，獲取其中的DNA、RNA，並且加以標記，以提高檢測的靈敏度。

3、生物分子反應，晶片上的生物分子之間的反應是晶片檢測的關鍵一步。

通過選擇合適的反應條件使樣品中的核酸分子與晶片上的核酸分子反應處於最佳狀況中，減少錯配比率。

4、晶片信號檢測，常用的晶片信號檢測方法是將晶片置入晶片掃描儀中，通過掃描以獲得有關生物信息。

基因晶片技術發展的最終目標是將從樣品製備、雜交反應到信號檢測的整個分析過程集成化以獲得微型全分析系統(micro total analytical system)或稱縮微晶片實驗室(laboratory on a chip)。

使用縮微晶片實驗室，就可以在一個封閉的系統內以很短的時間完成從原始樣品到獲取所需分析結果的全套操作。

近年,基因晶片技術在疾病易感基因發現、疾病分子水平診斷、基因功能確認、多靶位同步超高通量藥物篩選以及病原體檢測等醫學與生物學領域得到廣泛應用。

一、第一代基因晶片

第一代基因晶片基片可用材料有玻片、矽片、瓷片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜和尼龍膜,其中以玻片最為常用。

為保證探針穩定固定於載體表面,需要對載體表面進行多聚賴氨酸修飾、醛基修飾、氨基修飾、巰基修飾、瓊脂糖包被或丙烯醯胺矽烷化,使載體形成具有生物特異性的親和表面。

最後將製備好的探針固定到活化基片上,目前有兩種方法:原位合成和合成後微點樣。

根據晶片所使用的標記物不同,相應信號檢測方法有放射性核素法、生物素法和螢光染料法,在以玻片為載體的晶片上目前普遍採用螢光法。

相應螢光檢測裝置有雷射共聚焦顯微鏡、電荷偶合器( charge coup led devices, CCD)、雷射掃描螢光顯微鏡和雷射共聚焦掃描儀等。

其中的雷射共聚焦掃描儀已發展為基因晶片的配套檢測系統。

經過晶片掃描提取雜交信號之後,在數據分析之前,首先要扣除背景信號,進行數據檢查、標化和校正,消除不同實驗系統的誤差。

對於簡單的檢測或科學實驗,因所需分析基因數量少,故直接觀察即可得出結論。

若涉及大量基因尤其是進行表達譜分析時,就需要藉助專門的分析軟體,運用統計學和生物信息學知識進行深入、系統的分析,如主成分分析、分層聚類分析、判別分析和調控網絡分析等。

晶片數據分析結束並不表示晶片實驗的完成,由於基因晶片獲取的信息量大,要對呈數量級增長的實驗數據進行有效管理,需要建立起通行的數據儲存和交流平台,將各實驗室獲得的實驗結果集中起來形成共享的基因晶片資料庫,以便於數據的交流及結果的評估。

典型如SuperArray公司的功能分類基因晶片：

1、引物設計

SYBR Green可與所有的雙鏈DNA反應(包括引物二聚體)，為了使擴增反應集中於目的基因，避免非特異性擴增，引物設計成為關鍵因素。

為得到單一特異的擴增產物，避免擴增出序列相似的非特異性產物，採用BLAST或者其他比對方法，檢測引物在相應物種(如人，小鼠或大鼠)全基因組中的特異性。

為了保證在相同的PCR條件下(特別是統一的退火溫度)，不同基因均能擴增出相應的特異性產物，對引物的CG值，解鏈溫度(Tm)，以及其他化學和物理的特性都進行了優化調整。

為了獲得高擴增效率，對擴增片段的長度也進行了優化，一般為100到200bp，確保在統一的循環反應的時間範圍內，不同基因均能擴增出完整片段。

2、反應體系

為避免非特異性擴增，使用化學修飾的熱啟動Taq酶，只有經過熱激步驟，Taq酶才能發揮擴增活性。

同時，反應體系經過優化，可最大限度減少引物二聚體形成，並且保證較難擴增的片段都得到極高的擴增效率。

3、定量結果可靠

在標準的96孔PCR反應儀中進行實時定量PCR實驗，為了獲得高通量，無法為每個樣品單獨製備標準曲線。

在完全相同的PCR反應條件下，希望表達量不同的多個基因均獲得可靠的結果，需要確保每個基因都有較高的擴增效率，從而可採用簡單的△△Ct方法計算基因表達量。

其靈敏度高，樣品的使用量低，每張晶片使用的總RNA最少可為0.5ng;可觀察到的動態線性範圍超過105，可以同時檢測表達量差異較大的基因;Ct值的平均差異只有0.25個循環，可檢測超過兩倍的基因表達量變化。

因此，第二代功能分類基因晶片是研究特定信號通路或者一組功能相關基因表達量的理想方法。

二、第二代基因晶片

儘管基因晶片技術已經取得了長足的發展，但仍然存在著許多難題和不足。

目標分子的標記是重要的限速步驟，如何繞過這一步是人們一直期望解決的問題。

其次是檢測靈敏度不高，重複性差，無法檢測單鹼基錯配的基因樣品。

再者，待檢測的基因樣品必須經過PCR擴增技術的處理以獲得足夠量的待檢測樣品，使檢測過程相對複雜。

我們稱具備以上特徵的基因晶片技術為第一代基因晶片技術，這些特徵充分說明基因晶片技術本身存在著較大的發展空間。

第二代基因晶片包括如下幾種：

1. 電極陣列型基因晶片：將微電極在襯底上排成陣列，通過對氧化還原指示劑的電流信號的檢測實現基因序列的識別;

2. 非標記螢光指示基因晶片：利用螢光分子作為雜交指示劑，在不需對靶基因進行螢光標記的前提下，通過對螢光分子的檢測實現基因序列的識別;

3. 量子點指示基因晶片：利用量子點作為雜交指示劑，在不需對靶基因進行螢光標記的前提下，通過對量子點的掃描實現基因序列的識別;

4. 分子燈塔型基因晶片：利用探針DNA片斷的髮夾結構，獲得單鹼基突變檢測的能力。

三、第三代基因晶片

目前，眾多的第三代基因晶片現在也推向了市場。

第三代基因晶片代表了測序的最高水平和未來走向。

1、Illumina微珠基因晶片技術

這是Illumina公司核心技術之一，博奧生物基於Illumina微珠晶片平台，推出SNP分型檢測服務以及定製SNP分型檢測服務。

它首先用微機電技術在光纖末端或矽片基質上蝕刻出微孔(深度約為3毫米的相同凹槽)，將「微珠池「內的微珠「倒」入光纖束微孔，每個微孔恰可容納一個微珠，在范德華力和與微孔壁間流體靜力學相互作用下，微珠以「無序自組裝」的方式在微孔內組裝成晶片。

每種類型的微珠平均有 30 倍左右的重複。

每一個微珠上都偶聯有80萬左右拷貝數的探針。

每一個探針由特異的地址序列(對每種微珠進行解碼，29mer)和特異序列(代表不同的檢測信息，如SNP 位點序列、基因序列等)組成。

用專利的解碼技術對晶片上的微珠進行解碼，完成對晶片微珠定位信息的收集和確認，也實現晶片生產過程中100%質控。

以四種螢光標記進行16種微珠解碼為例，解碼過程使用與地址序列互補的且分別標記4種螢光染料的探針進行。

把標記4種螢光的不同地址序列探針進行組合，每次雜交後探針清洗下來進行下一輪雜交，通過多輪雜交達到指數型區分能力。

2、Ion Torrent半導體基因晶片

Ion Torrent半導體基因晶片是最新一代的測序技術，它的問世給測序技術的應用帶來了激動人心的進展。

它採用了半導體技術和簡單的化學試劑進行DNA測序，而不是使用光作為媒介。

在半導體晶片的微孔中固定DNA鏈，隨後依次摻入ATCG。

隨著每個鹼基的摻入，釋放出氫離子，在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，通過對H+的檢測，實時判讀鹼基。

Ion Torrent個人化操作基因組測序儀(PGMTM)是第一台基於半導體技術的測序儀。

與其他測序技術相比，使用該項技術的測序系統更簡單、更快速、及更易升級。

該測序儀與其他高通量測序儀特徵互補，可以迅速完成應急服務項目，縮短服務周期，增加服務效率。

3、實時單分子測序基因晶片

太平洋生物科學公司(PacBio)實時單分子測序基因晶片是直接測由DNA聚合酶將螢光標記的核苷酸摻入互補測序模板。

該技術的核心是一個零點啟動模式的波導(Zero-mode Wavelength，ZMW)納米結構的密集排列， 這一排列陣可以進行單個螢光分子的光學審視。

在過去，零點啟動模式波導結構被用於從大量高密度的分子中分辨出單一的螢光分子，還沒有被用於大量平行分析的操作。

為使之用於大量平行分析和數據輸出通量(測序數據生成能力)，太平洋生物科學公司開發出一種方法，能有效地將零點啟動模式波導結構排到表面上，他們採用了電子束光刻技術(Electron beam Lithography)和紫外光電子束光刻技術(Ultraviolet Photo lithography) 以及高度平行的共焦成像系統， 這樣可以對零點啟動模式納米結構中的螢光標記分子進行高靈敏度和高解析度的探測，並採用了一個沉重的穩定平台來確保良好的光學聚焦效果。

4、納米球基因晶片

全基因組學公司(Complete Genomics)的納米球基因晶片是以雜交和連接反應為核心的。

當通過雜交和連接進行測序的方法出現以後，全基因組學公司推出了新的樣品處理方法和納米陣列平台。

基因組DNA首先經過超聲處理，再加上一些接頭，然後模板環化，酶切。

最後產生大約400個鹼基的環化的測序片段，每個片段內含有4個明確的接頭位點。

環化片段用Φ29聚合酶擴增2個數量級。

一個環化片段所產生的擴增產物稱為DNA納米球(DAN nanoball, DNB)。

納米球被選擇性地連接到六甲基二矽氮烷處理的矽晶片上。

5、納米孔基因晶片技術

另外，還在發展中的納米孔基因晶片技術是很有潛力的第四代技術。

因為這種方法不再需要光學檢測和同步的試劑洗脫過程了。

這是一種基於納米孔(納米洞)結構的完全不同的測序技術，單個鹼基的讀取可以靠測定經由納米級別的孔洞而跨越或透過薄膜的電導率來進行。

納米孔技術可以廣泛地歸納為兩類：生物類和固態類。

α溶血素是一種能天然性地連接到細胞膜中繼而導致細胞溶解的蛋白質，它第一個被用來做成生物納米孔模型。

第二類納米孔是以矽及其衍生物進行機械製造而成。

使用這些合成的納米孔可以降低在膜穩定性和蛋白定位等方面的麻煩，而這些正是牛津納米孔公司所創立的生物納米孔系統一直遇到的問題。

例如，Nabsys就發明了一套系統，他們以匯聚的離子束將矽片薄膜打成納米孔，用於檢測與特異性引物進行了雜交的單鏈DNA穿過納米孔時的阻斷電流變化。

IBM創建了一個更為複雜的系統，能有效地使DNA位移暫停，並在暫停的時候通過隧道電流檢測識別每個鹼基。

四、基因晶片市場分析

1、國外市場美國illumina公司一家獨大

在SNP晶片研究領域，美國illumina公司毫無疑問是霸主，illumina公司憑藉自己開發的GoldenGate技術和infinium專利技術一直在SNP晶片領域處於壟斷地位。

illumina的全基因組表達譜晶片是目前唯一一種可以達到探針30倍重複的表達譜晶片，其他的晶片都只能達到1-8倍技術重複。

因此illumina的全基因組表達譜晶片的重複性是所有晶片中最高的，其重複性R2>0.996，並且基於第三代基因晶片獨特的微珠晶片生產工藝，晶片生產成本較低，信噪比和靈敏度都非常高，其靈敏度≤1:250,000，晶片檢測結果和qPCR相關係數R2=0.97。

因為illumina所占的市場份額越來越多，2012年6月另一基因晶片大廠家Nimblegen公司，正式宣布退出基因晶片市場。

2、國內市場剛剛起步

國內基因晶片製造水平低，相關的企業規模小、投入也少，遠達不到國外的水平。

所以國內的相關公司均以引進國外基因晶片，提供檢測服務為主。

不過，隨著基因晶片的應用推廣，一些公司也開始涉足基因晶片製造。

上市公司達安基因，業務以體外診斷為主，產品主要是試劑盒，但也開始涉足基因晶片製造。

達安基因2013年申報的三個專利：一種用於基因檢測的電路板 ZL201320244125.X;一種電化學基因晶片 ZL201320244116.0;一種基於基因晶片的檢測裝置 ZL201320244734.5。

而另一以基因檢測服務著稱的大企業華大基因，則通過收購國外公司進入基因晶片製造領域。

美國上市公司Complete Genomics 公司有自己基因晶片和晶片檢測設備。

但該公司2011年的業績只有2000多萬美元，其基因測序服務成長大大低於預期，股票跌破發行價，最後被中國華大基因收購。

聯川生物在microRNA晶片領域也小有名氣，也是唯一一家國產的microRNA晶片，該晶片最大的特點就是更新速度極快，一般新的資料庫發表後，第一個將晶片更新到最新版本的就是聯川生物。

illumina公司於2010年退出了microRNA晶片市場，因illumina公司2006年收購了高通量測序領域NO.1的Solexa公司，成為唯一一家即擁有晶片平台又擁有高通量測序平台的供應商，illumina認為在microRNA領域，高通量測序有不可比擬的技術優勢，必然會取代晶片，所以於2010年停產了microRNA晶片。

註：最新的測序技術會實現全自動化、實時化、微型化，雖然與傳統的晶片技術並不相同，但其理念有共通之處，所以也將其納入「晶片」範疇。

——彭雷