尿多酸肽抗骨髓增生異常綜合徵(MDS)藥理作用及其機制的研究進展

作者：浙江大學醫學院附屬第四醫院 黃健來源：腫瘤資訊

黃健主任醫師、碩士生導師

浙江大學醫學院附屬第四醫院血液內科執行主任

中國抗癌協會血液腫瘤分會骨髓增生異常綜合徵/骨髓增殖性腫瘤工作組專家委員會委員

中國老年醫學會血液病分會委員

浙江省中西醫結合學會血液病分會常委

浙江省醫學會罕見病分會委員

浙江省醫師協會血液科醫師分會委員

中國民族醫藥學會血液病分會理事

浙江省自然科學基金評審專家

已發表SCI論文 15篇，主持國家自然科學基金，省自然科學基金等項目7項，2006年在第四屆亞太血栓與止血會議獲得傑出青年獎

以主要成員獲得國家科技進步二等獎1項，省科技進步一等獎2項等

研究背景

骨髓增生異常綜合徵( myelodysplastic syndrome,MDS)是一組以不同程度外周血細胞減少伴骨髓無效造血為主要特徵的惡性克隆性疾病。

目前除造血幹細胞移植外，仍無有效治癒手段，其中IPSS中高危組患者治療尤為棘手，主要應用低劑量化療聯合細胞因子等治療，但其療效遠不如急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）。

多數MDS患者年齡超過70歲，無法耐受強烈化療方案和骨髓移植，必須依靠輸血維持生存，但最終轉化為AML後死亡。

雖然胞苷衍生物5－氮雜胞苷（5－aza－cytidine, Aza C）和5－氮雜－2』－脫氧胞苷（5－aza-2』-deoxycitidine, Decitabine, DAC）已被批准用於MDS的治療，但是因其骨髓抑制作用明顯，臨床應用受限，因此尋找療效好且骨髓抑制輕的新的治療方法以改善中高危MDS患者的預後，仍是目前MDS治療研究的焦點。

中國自古就有童子尿治病的記載，國內外應用尿及尿的提取物治療疾病也有幾十年的歷史。

尿多酸肽 （Uroacitides）, 又名CDA-II（cell differentiation agent II）是我國自主開發的一種抗腫瘤新藥，它是從健康人尿中經酸化、吸附、洗脫、真空乾燥等過程製成的含有多種有機酸和多肽成分的非細胞毒型藥物。

其主要成分為苯乙醯谷氨醯胺（占41％），馬尿酸（占35％），分子量在400－2800D的多肽（占17％），還有少量4－羥基苯乙酸和5－羥基吲哚乙酸，這些成分協同發揮抗腫瘤作用。

對某些實體瘤的研究證實，CDA-II具有誘導分化和誘導凋亡的雙重作用：低劑量CDA-II可以誘導多種實體瘤細胞向正常細胞分化；高劑量CDA-II可以誘導腫瘤細胞凋亡（機制目前仍處於研究階段），逆轉耐藥，防止腫瘤復發和轉移等。

我國國家食品藥品監督管理局（CFDA）已批准低劑量CDA-II用於某些腫瘤，如乳腺癌和非小細胞肺癌的治療。

高危MDS患者的特點是骨髓腫瘤細胞過度增殖，往往合併外周血三系減少，骨髓代償能力差，所以更需要尋找一種能抑制腫瘤細胞過度增殖，同時骨髓抑制作用輕的藥物。

CDA-II是從健康人尿中提取的有效成份，因而對人體正常細胞毒副作用小，骨髓抑制作用輕，與胞苷衍生物相比，患者的耐受性更好。

尿多酸肽抗骨髓增生異常綜合徵(MDS)藥理作用及其機制

一、尿多酸肽(CDA-II)通過影響細胞生存信號通路誘導MDS細胞凋亡

我們知道高危MDS患者細胞中Akt持續活化並異常高表達。

PI3K活化的Akt能夠作用於下游關鍵的凋亡蛋白，如Bcl-2家族成員的促凋亡因子Bad, 核因子kappa B(nuclear factor-kappa B ,NF-κB)等，使它們磷酸化進而介導細胞抗凋亡的生物學功能，並且NF-κB也在高危MDS患者體內被持續激活。

因此,我們就CDA-II對MDS細胞作用以及對MDS細胞PI3K/Akt及NF-κB生存信號途徑的影響進行研究。

我們採用MTT比色法研究CDA-II對MDS,白血病和淋巴瘤細胞株以及MDS原代細胞和正常人骨髓單個核細胞的體外生長抑制作用; 採用Wright-Giemsa染色、流式細胞儀PI染色檢測亞G1峰和Annexin V/PI雙染色檢測細胞凋亡；採用流式細胞儀PI染色檢測細胞周期、JC-1染色檢測細胞線粒體膜電位的改變;用Western-blot方法檢測CDA-II作用後MUTZ-1細胞Caspase家族,細胞周期蛋白,凋亡相關蛋白和凋亡抑制蛋白的表達;提取核漿蛋白以觀察CDA-II對NF-κB信號通路的影響; 檢測CDA-II對MUTZ-1細胞PI3K/Akt和NF-κB信號通路相關生存蛋白的影響,並進一步加用PI3K和NF-κB抑制劑來明確兩條信號通路的相關性;用RT-PCR方法檢測CDA-II對表達PI3Kp110α蛋白的PIK3CA基因的影響;用人MDS荷瘤小鼠模型觀察CDA-II對小鼠瘤體生長和平均生存期的影響以及比較用藥前後瘤組織細胞形態和p-Akt的原位表達,從而明確CDA-II在實驗動物水平對MDS細胞的生長抑制作用,並評估實驗治療劑量的安全性。

結果發現CDA-II在細胞水平可以抑制MDS,白血病和淋巴瘤細胞株生長,其中髓系白血病細胞株較淋系血液腫瘤細胞株更敏感; CDA-II可以抑制MUTZ-1細胞株和MDS原代細胞的生長,並呈濃度和時間依賴性,但不影響正常人骨髓單個核細胞的生長，對正常骨髓無抑制作用。

CDA-II可以誘導MUTZ-1細胞株和MDS原代細胞凋亡,並伴有G1期細胞周期阻滯,和細胞周期相關蛋白Cyclin D1和CDK4表達抑制。

CDA-II通過啟動內源性和外源性細胞凋亡途徑誘導Caspase-3依賴型細胞凋亡,並以內源性(線粒體)途徑為主,伴有明顯的線粒體膜電位下降。

CDA-II通過影響Bcl-2家族蛋白的表達以及抑制IAPs家族蛋白表達導致線粒體損傷和Caspase-9,3激活誘導細胞凋亡。

CDA-II在高濃度時,可以明顯抑制FLIPL表達,從而解除其對Caspase-8的抑制作用誘導凋亡。

CDA-II可以通過抑制IκBα磷酸化,從而抑制NF-κB核轉位來下調MUTZ-1細胞內源性及TNF-α誘導的NF-κB信號通路的活性並主要通過對PI3K/Akt信號通路的調控來實現。

CDA-II主要通過影響PIK3CA基因的表達而抑制PI3K/Akt信號通路,並進一步通過影響其下游信號蛋白而誘導MUTZ-1細胞凋亡。

PIK3CA基因為CDA-II作用的靶點。

CDA-II在動物實驗中可以明顯抑制人MDS荷瘤小鼠瘤體生長並延長小鼠平均生存期; 並在實驗治療劑量對小鼠無毒副作用。

二、尿多酸肽(CDA-II)對MDS細胞PTEN和p15INK4B基因異常甲基化模式的影響

表觀遺傳學異常在腫瘤發生髮展過程中的作用普遍受到重視。

其中DNA異常甲基化是MDS的重要發病機制之一。

在MDS患者細胞中DNMT1,DNMT3A,DNMT3B表達均增高,其中DNMT3B在高危組中表達較低危組高。

50%的MDS患者存在p15INK4B甲基化,並且高危MDS患者和部分MDS轉化的AML患者p15INK4B甲基化頻率更高。

CDA-II是一種複合製劑,在對實體瘤的研究中發現CDA-II不僅可以抑制細胞信號傳遞,誘導細胞凋亡,而且可以直接作用於腫瘤細胞中異常的DNMTs進而介導抑癌基因的去甲基化。

但是有關CDA-II對MDS細胞中異常高表達的DNMTs的作用未見報導。

為此我們用Western-blot方法檢測MUTZ-1細胞株、低危MDS、高危MDS、MDS轉化的AML患者和正常人骨髓單個核細胞中甲基轉移酶DNMT1、3A和3B以及抑癌基因PTEN和p15INK4B蛋白表達; 檢測CDA-II對MUTZ-1細胞甲基轉移酶DNMTs以及抑癌基因PTEN和p15INK4B表達影響; 用RT-PCR方法檢測CDA-II作用對MUTZ-1細胞甲基轉移酶DNMTs以及抑癌基因PTEN和p15INK4B mRNA表達影響; 用MSP方法檢測MUTZ-1和AML細胞株、低危MDS、高危MDS、MDS轉化的AML患者以及正常人骨髓單個核細胞中PTEN和p15INK4B的甲基化狀態; 檢測CDA-II對MUTZ-1細胞PTEN和p15INK4B甲基化狀態的影響。

結果發現CDA-II可以明顯下調MUTZ-1細胞甲基轉移酶DNMT1、3A和3B表達,效應呈時間和劑量依賴性,以對DNMT1的作用最明顯。

並發現抑癌基因PTEN在高危MDS和MDS轉化的AML中存在高度甲基化,很可能是MDS向AML轉變的一個重要的發病機制,靶向PTEN基因的去甲基化治療可以作為高危MDS和MDS轉化的AML患者的治療策略;CDA-II可以通過抑制甲基轉移酶DNMT1、3A和3B，導致抑癌基因PTEN和p15INK4B去甲基化而被激活,激活的PTEN可以進一步加強CDA-II對PI3K/Akt信號通路的抑制作用而誘導細胞凋亡；p15INK4B可以調控CDA-II對CDK4的抑制作用而誘導細胞G1期阻滯。

三、尿多酸肽(CDA-II)可以抑制MDS細胞端粒酶活性並下調人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)表達

端粒的不穩定性在MDS的發生中具有重要作用,端粒酶活性與MDS疾病進展密切相關。

人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)是端粒酶催化亞單位,是控制人細胞端粒酶活性的限速成分。

hTERT表達與MDS的發病和進展有關。

我們前期的研究也證實了hTERT表達與MDS發病和早期復發有關。

有關CDA-II影響腫瘤細胞端粒酶活性及hTERT表達的研究國內外均未見報導。

因此我們用TRAP法檢測不同濃度和時間CDA-II對MUTZ-1細胞端粒酶活性的影響; 用RT-PCR方法和Western-blot方法分別檢測CDA-II作用對MUTZ-1細胞hTERT mRNA和蛋白表達的影響;檢測CDA-II作用對MUTZ-1細胞WT1基因表達的影響; 並檢測CDA-II與PI3K抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC聯用對MUTZ-1細胞hTERT蛋白表達的影響。

結果發現CDA-II對MDS細胞端粒酶和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)具有抑制作用,且CDA-II可以通過抑制MUTZ-1細胞端粒酶活性來誘導細胞凋亡,並呈時間和劑量依賴性,這很可能是CDA-II誘導MUTZ-1細胞凋亡的Caspase-3非依賴途徑。

CDA-II可以抑制MUTZ-1細胞hTERT mRNA和蛋白表達,並呈濃度和時間依賴性,這種抑制作用與CDA-II對端粒酶的作用相一致,並與凋亡相關。

因此, 可以認為hTERT是CDA-II治療MDS的新的靶點。

CDA-II可以下調MUTZ-1細胞WT1基因的表達,並呈濃度和時間依賴性,由於WT1基因是hTERT啟動子的調控基因,提示CDA-II可以通過下調WT1基因表達來抑制hTERT表達從而抑制端粒酶活性。

CDA-II主要通過抑制PI3K/Akt/ NF-κB信號通路來抑制MUTZ-1細胞hTERT蛋白表達,而導致細胞端粒酶活性喪失並誘導凋亡。

我們的研究首次闡明了CDA-II對腫瘤細胞端粒酶和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)具有抑制作用,為CDA-II的臨床應用提供了一個新的靶點,具有首創性;CDA-II可以通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路和WT1基因的表達來下調MUTZ-1細胞hTERT基因表達,進而抑制細胞端粒酶活性,並誘導Caspase-3非依賴型細胞凋亡。

尿多酸肽抗骨髓增生異常綜合徵(MDS)藥理作用小結

CDA-II在細胞水平和動物水平均能抑制MDS細胞生長,其機理主要為誘導細胞凋亡; CDA-II對正常人骨髓沒有抑制作用,對實驗動物也無明顯毒副作用; CDA-II是一種多靶向性藥物,通過多種成分的共同作用來誘導MDS細胞凋亡,主要通過直接影響PI3K/Akt/NF-κB生存信號通路、通過去甲基化作用激活抑癌基因PTEN和p15INK4B以及通過影響hTERT的表達來抑制細胞端粒酶活性三種機制發揮作用(見附圖)。

本研究為MDS治療藥物的選擇及探討藥物作用機制提供了體外細胞水平和體內動物水平的實驗基礎,為臨床上MDS的靶向治療提供了新的思路和方法。

已發表的相關論文

1. Huang J, Yang M, Liu H, Jin J. Human urine extract CDA-2 induces apoptosis of myelodysplastic syndrome-derived MUTZ-1 cells through the PI3K/Akt signaling pathway in a caspase-3-dependent manner Acta Pharmacol Sin 2008.8; 29(8): 951-964.

2. Huang J, Yang M, Liu H, Jin J. CDA-II, a urinary preparation, induces growth arrest and apoptosis of human leukemia cells through inactivation of nuclear factor-κappaB in a caspase-dependent manner. Food Chem Toxicol. 2009. 1;47(1):40-49.

3. Huang J, Yang M, Jin J. Effects of uroacitides on the methylation of PTEN gene in myelodysplastic syndrome cells and its mechanism. Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi. 2013 Jul;34(7):600-5. doi: 10.3760/cma.j.issn.0253-2727.2013.07.009. Chinese.

4.Huang J, Jin J. Low-Dose Uroacitides(CDA-II) Downregulates Telomerase Activity and Inhibits Proliferation in the Telomerase-Expressing Maliganant Cell Lines Through Inactivation of Akt Signaling Pathway. Blood 2012；120:4920

圖：CDA-II通過多八點共同作用誘導MUTZ-1 細胞凋亡

（黑色箭頭為文中機制介紹的第一部分內容；藍色箭頭為第二部分內容；紅色箭頭為第三部分內容）

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